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【摘要】 目的：利用生物信息學(xué)方法研究核受體輔激活因子4（NCOA4）表達(dá)與人腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）患者總生存時(shí)間的關(guān)系并探討其潛在機(jī)制。方法：將來(lái)源于癌癥基因組圖譜（TCGA）的152例GBM患者先按三等分法分為NCOA4高、中、低表達(dá)組（n=51、50、51），再按最佳界值法分為NCOA4高表達(dá)組（n=29）與低表達(dá)組（n=123），比較各組生存時(shí)間。將來(lái)源于人類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)匯編（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE7696數(shù)據(jù)集的70例GBM患者按三等分法分為NCOA4高、中、低表達(dá)組（n=23、24、23）。比較各組生存時(shí)間，分析影響GBM患者術(shù)后獨(dú)立預(yù)后因素?；赥CGA中GBM患者的level 3 RNASeqV2基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析確定NCOA4在GBM中發(fā)揮作用的關(guān)鍵機(jī)制。結(jié)果：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)三等分法分組的NCOA4高表達(dá)組中位生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于NCOA4中、低表達(dá)組（P=0.005）;根據(jù)最佳界值法分組的NCOA4高表達(dá)組中位生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組（P<0.001）。GSE7696數(shù)據(jù)集中NCOA4高表達(dá)組中位生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于NCOA4中、低表達(dá)組（P=0.022）。NCOA4表達(dá)水平為影響術(shù)后GBM患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.041）。在GBM中發(fā)揮作用的關(guān)鍵是溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子和Toll樣受體相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)論：NCOA4表達(dá)增高是預(yù)測(cè)術(shù)后GBM患者預(yù)后良好的獨(dú)立因素，而溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子和Toll樣受體作用的增強(qiáng)可能是NCOA4在GBM中影響預(yù)后的重要作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 核受體輔激活因子4 生物信息學(xué) 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

[Abstract] Objective： To study the relationship between the expression of nuclear receptor coactivator 4 （NCOA4） and the total survival time of patients with human brain glioblastoma multiforme （GBM） by bioinformatics method and to explore its potential mechanism. Method： The 152 GBM patients derived from the cancer genome atlas （TCGA） were firstly divided into NCOA4 high， medium and low expression groups （n=51， 50， 51） according to the trisection method， and then divided into NCOA4 high expression group （n=29） and low expression group （n=123） according to the optimal cutoff method. The survival time of each group was compared. The 70 GBM patients from the GSE7696 dataset of the human tumor related gene expression omnibus （GEO） database were divided into NCOA4 high， medium and low expression groups （n=23， 24， 23）. Survival time of each group was compared， and independent prognostic factors affecting postoperative GBM patients were analyzed. Gene set enrichment analysis was performed based on level 3 RNASeqV2 genomic data of GBM patients in TCGA to determine the key mechanism of the role of NCOA4 in GBM. Result： In TCGA database， the median survival time of the NCOA4 high expression group grouped according to the method of trisection were significantly higher than those of the NCOA4 medium and low expression group （P=0.005）. The median survival time of the NCOA4 high expression group grouped according to the optimal cutoff method was significantly higher than that of the low expression group （P<0.001）. The median survival time of the NCOA4 high expression group in GSE7696 data set were significantly higher than those of the NCOA4 medium and low expression group （P=0.022）. The expression level of NCOA4 was an independent prognostic factor for the postoperative GBM patients （P=0.041）. The key roles in GBM were lysosomes， natural killer cell-mediated cytotoxicity， chemokines， and Toll-like receptor related signaling pathways. Conclusion： The increased expression of NCOA4 is an independent factor in predicting the favourable prognosis of postoperative GBM patients， and lysosomes， natural killer cell-mediated cytotoxicity， chemokines and Toll-like receptor enhancement may be the important mechanisms of NCOA4 affecting the prognosis in GBM.

[Key words] Nuclear receptor coactivator 4 Bioinformatics Glioblastoma multiforme

First-authors address： Panjin City Centre Hospital， Panjin 124010， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.038

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）作為顱內(nèi)惡性程度最高的惡性腫瘤，患者多于確診2年內(nèi)死亡，除血供豐富、高度浸潤(rùn)以及逃逸攻擊等機(jī)制外，其獨(dú)特的發(fā)生發(fā)展機(jī)制備受廣大研究者關(guān)注[1]。研究表明GBM不但進(jìn)展迅速，而且異質(zhì)性顯著，因此在大規(guī)模數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，深入探討GBM發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素及分子機(jī)制，對(duì)于優(yōu)化GBM的診治和改善患者的生存，具有重要的臨床指導(dǎo)意義[2]。核受體輔激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4），也被稱為雄激素受體相關(guān)蛋白70（ARA70），可與雄激素受體AR結(jié)合并依賴于配體的結(jié)合增強(qiáng)AR及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，也可以作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ的共激活因子以配體非依賴性的方式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔助功能[3-4]。最初是作為RET融合基因在一系列乳頭狀甲狀腺癌被發(fā)現(xiàn)的。后來(lái)研究表明NCOA4為多種核受體的共激活因子，是調(diào)節(jié)鐵代謝的重要蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和系統(tǒng)內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5]。近年來(lái)研究表明，NCOA4被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種惡性腫瘤如胰腺癌，膀胱癌等并影響惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為發(fā)揮作用[6]。但關(guān)于NCOA4在GBM中的表達(dá)及預(yù)后，尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)整合在線高通量數(shù)據(jù)，利用單因素和多因素的生存分析結(jié)合基因集富集分析（GSEA），明確NCOA4表達(dá)對(duì)GBM術(shù)后患者預(yù)后的預(yù)測(cè)作用以及潛在作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)篩選 生物信息學(xué)研究數(shù)據(jù)的主要篩選條件：（1）具有完整的生存資料;（2）基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)完整。首先，通過(guò)檢索人類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)匯編（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncb.nlm.nih.gov/geo），獲取GBM樣本GSE7696數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù);其次，檢索并獲取癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）中GBM患者的level 3 RNASeqV2基因組數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 初步確定NCOA4表達(dá)與GBM患者總生存的關(guān)系 針對(duì)來(lái)源于TCGA的患者數(shù)據(jù)，首先對(duì)GBM組織中NCOA4表達(dá)量進(jìn)行排序，通過(guò)三等分法，以66.67%和33.33%作為NCOA4表達(dá)量分級(jí)的界值將GBM患者分為高、中、低表達(dá)三組，結(jié)合患者的總生存率，分別采用R/survival函數(shù)包survfit和plot函數(shù)以及survdiff函數(shù)先后繪制Kaplan-Meier（K-M）生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)計(jì)算P值。然后根據(jù)R/Maxstat函數(shù)包獲取該數(shù)據(jù)集中NCOA4表達(dá)量分級(jí)的最佳界值，再按最佳界值法將GBM患者分為NCOA4高表達(dá)組和低表達(dá)組，重復(fù)上述K-M log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此先后通過(guò)三等分法和最佳界值法初步確定NCOA4表達(dá)與GBM患者總生存的關(guān)系。

1.2.2 GEO數(shù)據(jù)集對(duì)TCGA數(shù)據(jù)生存分析的結(jié)果進(jìn)行外部驗(yàn)證 針對(duì)來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GSE7696數(shù)據(jù)集，先對(duì)GBM組織中NCOA4表達(dá)量進(jìn)行排序，通過(guò)三等分法，以66.67%和33.33%作為界值將GBM患者分為高、中、低表達(dá)三組。結(jié)合患者總生存時(shí)間，先利用K-M log-rank 法繪制生存曲線并計(jì)算P值，再進(jìn)行Cox多因素回歸分析，與患者年齡，性別和術(shù)后治療方案等指標(biāo)進(jìn)行協(xié)同分析，確定NCOA4表達(dá)對(duì)于術(shù)后GBM患者總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值。以P<0.05作為差異顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 基因集富集分析（GSEA）明確NCOA4在GBM中的關(guān)鍵作用機(jī)制 利用TCGA數(shù)據(jù)集，首先根據(jù)GBM組織中NCOA4表達(dá)量的中位值（2.97）將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，再利用GSEA 2.2.2版軟件，以MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的h.all.v5.2.symbols.gmt數(shù)據(jù)集為參照基因集，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次，進(jìn)行加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)分析，找出與NCOA4表達(dá)水平顯著相關(guān)的基因集，即為NCOA4參與的信號(hào)通路。P<0.05且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）<0.25作為顯著富集基因集的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同NCOA4表達(dá)與GBM患者的生存關(guān)系 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共152例GBM患者[男98例，女54例，年齡為60.5（51.8，70.0）歲]，根據(jù)三等分法分為NCOA4高、中、低表達(dá)組（n=51、50、51），進(jìn)一步K-M生存分析顯示NCOA4高表達(dá)組生存時(shí)間為510（388，737）d明顯長(zhǎng)于NCOA4中、低表達(dá)組的384（329，505）和382（239，442）d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），見(jiàn)圖1A。其次，利用最佳界值法，以NCOA4表達(dá)量分級(jí)的最佳界值4.3（maxstat函數(shù)分析，見(jiàn)圖1B）作為標(biāo)準(zhǔn)，將GBM患者分為NCOA4高表達(dá)組（29例）和低表達(dá)組（123例），K-M分析進(jìn)一步證實(shí)NCOA4高表達(dá)組的生存時(shí)間為632（489，未達(dá)到）d明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組的384（335，442）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)圖1C。

2.2 GSE7696數(shù)據(jù)集中不同NCOA4表達(dá)與GBM患者的生存關(guān)系及預(yù)后影響因素 根據(jù)GSE7696中70例術(shù)后GBM患者的series matrix數(shù)據(jù)和生存信息進(jìn)行分析，其中男51例，女19例;年齡為52.2（45.6，57.1）歲。NCOA4高表達(dá)患者23例，中表達(dá)患者24例，低表達(dá)患者23例。NCOA4高表達(dá)患者生存時(shí)間為17.0（10.6，未達(dá)到）個(gè)月明顯長(zhǎng)于中、低表達(dá)患者的14.3（9.1，16.0）個(gè)月、14.3（8.9，17.3）個(gè)月（P=0.022），見(jiàn)圖2。Cox多因素回歸分析顯示，NCOA4表達(dá)水平為影響術(shù)后GBM患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.041），NCOA4高表達(dá)的患者預(yù)后良好，見(jiàn)表1。

2.3 GSEA確定NCOA4在GBM的關(guān)鍵作用機(jī)制 NCOA4高表達(dá)與KEGG_LYSOSOME，KEGG_NATURAL_KILLER_CELL_MEDIATED_CYTOTOXICITY，KEGG_TOLL_LIKE_RECEPTOR_SINGALING_PATHWAY和KEGG_CHEMOKINE_SINGALING_PATHWAY等基因集顯著相關(guān)（P<0.01），因此，參與溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子和Toll樣受體等信號(hào)通路為NCOA4影響術(shù)后GBM患者預(yù)后的關(guān)鍵機(jī)制。見(jiàn)圖3。

3 討論

鐵死亡（ferroptosis）是2012年美國(guó)Brent R. Stockwell實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡方式[7]。鐵死亡同其他細(xì)胞死亡方式一樣受信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其發(fā)生的關(guān)鍵是鐵的累積和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。鐵蛋白（ferritin）能夠調(diào)節(jié)鐵離子誘導(dǎo)的鐵死亡的發(fā)生，它能被特異性受體NCOA4識(shí)別，從而形成自噬小體參與溶酶體的降解，并導(dǎo)致游離鐵離子的釋放[8]。近年來(lái)對(duì)鐵死亡的深入研究表明，細(xì)胞的鐵死亡與癌癥、腎衰竭、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病等多種疾病相關(guān)[8]。另外目前研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞比其他腫瘤細(xì)胞能夠更有效地從微環(huán)境中攝取鐵，鐵死亡的失控可能與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展存在密切的關(guān)系[9]。研究表明在鐵死亡中NCOA4是一種選擇性的運(yùn)載受體，可用于鐵蛋白的選擇性自噬;同樣NCOA4的遺傳抑制可抑制鐵蛋白降解，并抑制鐵死亡。Gao等[10]通過(guò)RNAi技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一批自噬相關(guān)基因參與調(diào)解鐵死亡過(guò)程，敲除自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7或NCOA4可以抑制鐵蛋白自噬性降解過(guò)程，從而抑制細(xì)胞鐵死亡;過(guò)度表達(dá)NCOA4則可以通過(guò)促進(jìn)鐵蛋白降解誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。本文首先利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)集，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，證實(shí)在GBM組織中，NCOA4高表達(dá)患者的生存期更長(zhǎng)，兩個(gè)數(shù)據(jù)集的結(jié)果基本一致。結(jié)果提示GBM組織中NCOA4低表達(dá)者預(yù)后較差，故NCOA4表達(dá)可作為評(píng)價(jià)GBM患者預(yù)后的指標(biāo)。

膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展涉及眾多通路相互作用形成信號(hào)通路網(wǎng)共同發(fā)揮作用，已有研究表明，NK介導(dǎo)的細(xì)胞毒性信號(hào)通路可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用起到抑癌作用，減弱NK細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖并最終影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[11]。另外多種趨化因子及其受體在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、增殖、存活、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。研究發(fā)現(xiàn)在鐵自噬發(fā)生過(guò)程中需要NCOA4作為貨物受體特異性的識(shí)別鐵蛋白與自噬小體結(jié)合，通過(guò)自噬-溶酶體途徑可調(diào)控鐵自噬的發(fā)生[13]。同時(shí)Toll樣受體信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、分化、入侵及遷移至關(guān)重要，激活Toll樣受體信號(hào)通路，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、侵襲力增強(qiáng)，最終影響患者預(yù)后[14]。為研究NCOA4高表達(dá)狀態(tài)所激活的信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本文采用基因富集分析進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NCOA4高表達(dá)時(shí)可激活上述四條影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的重要信號(hào)通路。

綜上所述，本研究利用TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)出GBM組織NCOA4高表達(dá)提示GBM患者預(yù)后更好，NCOA4可能參與調(diào)節(jié)溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子和Toll樣受體四條信號(hào)通路，最終影響患者預(yù)后。本文通過(guò)研究調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，探索膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，為尋找膠質(zhì)瘤綜合治療的新靶點(diǎn)提供幫助。

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（收稿日期：2020-04-10） （本文編輯：田婧）