彭麗嬌　吳廷瑞　李驍　黃靜

【摘要】 目的：探討miR-508-5p對骨肉瘤細胞自噬及雷帕霉素靶向基因（mTOR）信號通路的影響。方法：收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織，另購買人骨肉瘤細胞株MG-63與人成骨細胞hFOB，采用RT-PCR法檢測各組織與細胞中miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量;將MG-63細胞分成三組：空白組不進行轉(zhuǎn)染，NC組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，過表達組轉(zhuǎn)染miR-508-5p重組質(zhì)粒，采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后的三組細胞增殖情況，流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率，采用RT-PCR法檢測各組miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量;采用Western blot法檢測細胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量。結(jié)果：相比癌旁正常組織與hFOB細胞，癌組織與MG-63細胞中miR-508-5p相對表達量均明顯降低，而mTOR mRNA的相對表達量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;相比空白組與NC組，過表達組miR-508-5p相對表達量明顯上升，mTOR mRNA的相對表達量明顯降低，細胞OD值明顯降低，凋亡率明顯增加，Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量均升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：miR-508-5p在骨肉瘤細胞中呈現(xiàn)低表達趨勢，過表達miR-508-5p后可通過抑制mTOR通路，引發(fā)細胞自噬，從而抑制細胞增殖與促進細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 miR-508-5p 骨肉瘤 細胞自噬 雷帕霉素靶向基因 細胞系

[Abstract] Objective： To investigate the effect of miR-508-5p on autophagy and rapamycin targeting gene （mTOR） signaling pathway in osteosarcoma cells. Method： A total of 59 cases of osteosarcoma in our hospital in the past five years were collected from cancer tissues and adjacent tissues， and human osteosarcoma cell line MG-63 and human osteoblasts hFOB were purchased. miR-508-5p and mTOR were detected by RT-PCR MG-63 cells were divided into three groups： blank group was not transfected， NC group was transfected with empty plasmid， over expression group was transfected with miR-508-5p recombinant plasmid， CCK-8 method was used to detect the proliferation of three groups of cells after transfection， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of three groups， RT-PCR method was used to detect the relative expression of miR-508-5p and mTOR mRNA in each group; Western blot was used to detect the relative expression of mTOR， Bax， Bcl-2， LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ in the cells. Result： The relative expression of miR-508-5p in cancer tissue and MG-63 cell were significantly lower than those in normal tissue and hFOB cell， while the relative expression of mTOR mRNA were significantly higher， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with the blank group and NC group， the relative expression of miR-508-5p， mTOR mRNA， odvalue， apoptosis rate， Bax and LC3-Ⅱ protein in the overexpression group increased significantly， while the relative expression of mTOR， Bcl-2 and LC3-Ⅰ protein decreased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-508-5p was low in osteosarcoma cells， and the over expression of miR-508-5p can induce autophagy by inhibiting mTOR pathway， thus inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis.

[Key words] miR-508-5p Osteosarcoma Autophagy Mammalian target of rapamycin Cell line

First-authors address： The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.002

骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是由于間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的遺傳與表觀遺傳分化引起的一種惡性腫瘤，在兒童與青少年中較為常見。骨肉瘤生長迅速，有著較高的組織破壞性與遷移率，傳統(tǒng)的手術(shù)切除預(yù)后并不理想，因此，尋找新的有效控制措施對改善患者的預(yù)后有著十分重要的意義[1-2]。近年來分子靶向治療為臨床及研究的熱點，與腫瘤形成與進展的信號通路及相關(guān)的基因相繼被發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）則是其中一類。相關(guān)研究表明，miR-508-5p在骨肉瘤中表達異常，且與骨肉瘤的分期有關(guān)，可能參與骨肉瘤的發(fā)生與進展，有望成為新的靶向治療點[3]。雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin，mTOR）是與腫瘤形成密切相關(guān)的一個重要的真核細胞信號，參與免疫抑制、轉(zhuǎn)錄與蛋白合成，具有調(diào)節(jié)細胞自噬、生長與凋亡等，在多種癌癥中表達異常，其調(diào)控的信號機制目前研究得較多[4-6]?；诖?，本文探討了骨肉瘤中miR-508-5p表達及其可能的調(diào)控信號機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織，所有患者均經(jīng)影像學(xué)檢查與術(shù)后病理確診為骨肉瘤，患者組織收集前未進行過放化療。59例患者中男38例，女21例，平均年齡（21.50±10.55）歲。

1.2 材料與試劑 人骨肉瘤細胞MG-63與人成骨細胞hFOB1.19均來源于中科院細胞庫，MEM與DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，LipofectaminTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，Taqman miRNA檢測試劑盒與實時熒光PCR儀購自美國ABI公司，兔抗人抗體與GAPDH兔抗人抗體、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自美國Sigma公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國KPL公司，RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自上海索萊寶生物技術(shù)公司，ECL電化學(xué)發(fā)光顯影液購自Invitrogen，CCK8試劑盒購自南京固與生物，引物序列由廣州生工生物設(shè)計合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與分組 將hFOB細胞株培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于33.5 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，MG-63細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，得到對數(shù)期生長MG-63細胞，隨機分為三組進行相應(yīng)的操作：空白組不進行轉(zhuǎn)染，NC組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，過表達組轉(zhuǎn)染miR-508-5p重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h。以下每組檢測均設(shè)置3個平行復(fù)孔，每孔重復(fù)檢測3次取平均值。

1.3.2 各組織與細胞中mRNA相對表達量的測

定 對所有患者癌組織與癌旁正常組織、未轉(zhuǎn)染的對數(shù)期MG-63與hFOB細胞、轉(zhuǎn)染后的三組細胞分別提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，采用RT-PCR法檢測miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算相對表達含量。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h后的三組細胞以胰酶消化，制成細胞懸液，取100 μL/孔接種于96孔板，加入CCK-8后在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將轉(zhuǎn)染48 h的三組細胞以胰酶消化，收集于流式管內(nèi)，6 ℃預(yù)冷孵育，以1*Annexin V結(jié)合液懸浮細胞，Annexin V-FITC著色，置于4 ℃冰箱避光靜置后，加入PI混勻靜置，使用流式細胞儀檢測，計算三組凋亡率（%）=（早晚期凋亡細胞數(shù)之和/總細胞數(shù)）×100%。

1.3.5 Western blot檢測蛋白相對表達量 提取轉(zhuǎn)染后三組細胞的總蛋白，BCA法檢測各組蛋白濃度，進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)、封閉，添加一抗后4 ℃孵育過夜，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG后在室溫孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光顯色，掃描條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算各蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行比較，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織及其細胞系中miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量比較 與癌旁正常組織（1.22±0.47）比較，骨肉瘤組織中miR-508-5p相對表達量（0.41±0.15）明顯降低（t=7.767，P<0.05）;與癌旁正常組織（1.03±0.31）比較，骨肉瘤組織中mTOR mRNA的相對表達量（1.62±0.59）明顯升高（t=7.853，P<0.05）;與人成骨細胞hFOB（1.07±0.08）比較，骨肉瘤細胞系MG-63中miR-508-5p相對表達量（0.53±0.09）明顯降低（t=7.767，P<0.05）;與人成骨細胞hFOB（0.98±0.09）比較，骨肉瘤細胞系MG-63中mTOR mRNA的相對表達量（1.59±0.10）明顯升高（t=7.853，P<0.05）。見圖1。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染后三組細胞miR-508-5p與mTOR mRNA的相對表達量比較 相比空白組（0.61±0.11）與NC組（0.65±0.10），過表達組miR-508-5p相對表達量（6.38±1.82）明顯上升（F=29.757，P<0.05）;相比空白組（1.16±0.09）與NC組（1.08±0.11），過表達組mTOR mRNA的相對表達量（0.61±0.11）明顯降低（F=26.315，P<0.05）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后三組細胞增殖情況與凋亡率比較 相比空白組（0.58±0.03）與NC組（0.55±0.06），過表達組細胞48 h OD值（0.36±0.04）明顯降低（F=21.000，P<0.05）;相比空白組（3.26±0.73）%與NC組（3.24±0.61）%，過表達組48 h細胞凋亡率（15.39±1.95）%明顯增加（F=93.922，P<0.05）。見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后三組細胞中mTOR、Bax、Bcl-2與LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量比較 相比空白組與NC組，過表達組細胞Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），

見表1。

3 討論

miRNA是一種具有廣泛基因調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA，具有多種生物學(xué)功能，可以通過與目標(biāo)mRNA的非編碼區(qū)域以堿基配對的方式結(jié)合，從而促使mRNA降解或翻譯過程受阻滯，沉默相應(yīng)的下游基因表達，進一步調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種病理生理活動，包括細胞周期調(diào)控、細胞增殖、分化與凋亡等過程[7-9]。相關(guān)研究指出多種miRNA均參與了骨肉瘤的發(fā)生、進展，例如，miR-34a作為抑癌基因p53的直接靶向miRNA，過表達后可以抑制腫瘤細胞增殖;miR-570-3p表達上調(diào)可抑制肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白與凋亡相關(guān)的翻譯從而抑制骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移;miR-222可通過下調(diào)腫瘤啟動因子從而抑制腫瘤細胞增殖與侵襲能力[10-12]。除此之外，不斷有新的miRNA在臨床研究中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這將為骨肉瘤的藥物治療提供新的靶點。

本研究通過對本院收治的109例骨肉瘤患者的癌組織與癌旁正常組織進行分子檢測，發(fā)現(xiàn)miR-508-5p在癌組織中呈現(xiàn)低表達趨勢，而mTOR則呈現(xiàn)高表達趨勢，提示這兩種分子均可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。既往關(guān)江鋒等[3]通過檢測66例骨肉瘤組織和31例骨軟骨瘤組織中miR-508-5p的表達量亦發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miR-508-5p呈低表達，其表達量與分期及AKP水平有關(guān)，通過生存分析還發(fā)現(xiàn)miR-508-5p低表達與患者較短生存期相關(guān)，提示其對預(yù)后有一定價值[3]。mTOR是細胞自噬調(diào)控通路中關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，可以通過影響下游自噬復(fù)合體的形成，進而抑制細胞自噬，在多種癌癥中已被發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)高表達趨勢[13-15]。同樣在骨肉瘤細胞系MG-63細胞與成骨細胞hFOB中亦表現(xiàn)出癌組織與正常組織中的差異，亦可說明同樣的道理。

為進一步驗證miR-508-5p與骨肉瘤細胞自噬的關(guān)系，筆者構(gòu)建了miR-508-5p重組質(zhì)粒過表達載體轉(zhuǎn)染細胞株，通過RT-PCR檢測證明轉(zhuǎn)染組miR-508-5p相對表達量明顯上升，mTOR mRNA的相對表達量明顯降低，表明過表達的細胞模型構(gòu)建成功。相比空白組與NC組，過表達組細胞OD值明顯降低，凋亡率明顯增加，這進一步提示上調(diào)miR-508-5p的表達可抑制腫瘤細胞增殖與促進細胞凋亡，具體的機制可能與如下的分子檢測結(jié)果相關(guān)。通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)Bax與LC3-Ⅱ蛋白表達量均升高，而mTOR、Bcl-2與LC3-Ⅰ蛋白相對表達量均降低。Bax與Bcl-2是一對拮抗的調(diào)控細胞凋亡因子，Bax升高而Bcl-2降低導(dǎo)致細胞凋亡率升高[16-17];而LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ則是與自噬相關(guān)的一對調(diào)控因子，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加導(dǎo)致細胞自噬增多，這與mTOR比值降低時協(xié)同發(fā)生，導(dǎo)致骨肉瘤細胞自噬增加，從而使得細胞增殖率降低，凋亡率升高[18-19]。

綜上所述，miR-508-5p在骨肉瘤細胞中呈現(xiàn)低表達趨勢，過表達miR-508-5p后可通過抑制mTOR通路，引發(fā)細胞自噬，從而抑制細胞增殖與促進細胞凋亡。

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（收稿日期：2020-04-09） （本文編輯：張爽）