余蘭林,姬賽賽,禹金龍,付文靜,張 林,李蛟龍,高 峰,江 蕓,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

大腸桿菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是主要食源性致病菌之一,可通過污染的食物和水源傳播,其感染劑量低、致病力較強(qiáng),人體感染后引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合癥等[1-2]。該菌最主要毒力因子是志賀毒素(Shiga toxin,Stx),由stx1和stx2基因編碼,可造成內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致急性腎功能衰竭。此外,eae基因編碼的緊密茹附素,可使病原菌茹附在腸細(xì)胞上從而引起茹附-脫落損傷;hly編碼腸溶血素,是引起腸外損傷的重要毒力因子,對淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞及靜脈管狀細(xì)胞等都有影響[3-4]。

食品加工和貯藏過程中涉及多種處理方法,如加熱、干燥、冷藏冷凍、酸化、腌制、使用防腐劑等,這些處理對微生物造成脅迫,抑制甚至殺滅有害微生物,從而延長食品貨架期。添加食鹽是其中常見的一種手段,可降低水分活度,低水分活度可導(dǎo)致細(xì)菌質(zhì)壁分離,影響大腸桿菌糖類主動轉(zhuǎn)運(yùn)和DNA復(fù)制[5],不利于微生物的生長繁殖,但也有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7等致病菌在低水分活度食品中可長期存活[6]。研究表明,環(huán)境應(yīng)激不僅影響致病菌的存活,還使其毒力特性發(fā)生改變,有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可導(dǎo)致致病菌毒力基因的表達(dá)增加,但也有研究報道應(yīng)激后致病菌毒力基因的表達(dá)下降或無顯著變化[3,7-8]。含鹽食品中腸出血性大腸桿菌引發(fā)人群感染事件時有發(fā)生,如發(fā)酵香腸、奶酪、腌菜、沙拉等[9-12],這些事件表明鹽應(yīng)激下大腸桿菌O157:H7仍存在較大安全風(fēng)險,探討鹽應(yīng)激下大腸桿菌O157:H7存活與毒力的相關(guān)性,具有重要的科學(xué)意義。鹽應(yīng)激對大腸桿菌O157:H7毒力特性的影響也有不同報道,Harris等[13]發(fā)現(xiàn)LB(Luria-Bertani)肉湯培養(yǎng)基中添加2% NaCl增加了stx2基因表達(dá),但添加3% NaCl對stx2表達(dá)量無影響。Olesen等[14]研究發(fā)現(xiàn)4.5%鹽應(yīng)激24 h顯著增加了大腸桿菌O157:H7 EDL933菌株毒力基因(eae、stx1A、stx2A和tir)的表達(dá),但卻抑制了另外2 株STEC(O157:H7和O157:H-)毒力基因表達(dá),存在菌株差異。目前,關(guān)于較高NaCl添加量對食源性致病菌毒力的影響少見報道,如一些腌制肉制品、醬料中含鹽量高達(dá)15%以上。因此本研究以本實(shí)驗(yàn)室收集的3 株大腸桿菌O157:H7產(chǎn)毒菌株為對象,探討較高NaCl添加量應(yīng)激對菌株存活和毒力基因表達(dá)的影響,進(jìn)一步分析其存活與毒力變化之間的相關(guān)性,以期為實(shí)際含鹽食品風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)于NaCl添加量應(yīng)激水平的設(shè)立有不同報道,在胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)或LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,設(shè)有1%～3%[13]、2%～5.5%[15]、3.5%～8.5%[16]、0.5%～8.5%[17]、3%～18%[18]等不同NaCl水平,因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)立6、12、18 g/100 mL NaCl水平作為較高NaCl添加量應(yīng)激條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 株大腸桿菌O157:H7來源及攜帶毒力基因情況如下:大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530(stx1+、stx2+、eae+、hly+)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;大腸桿菌O157:H7菌株95(stx1+、hly+)和菌株109(eae+、hly+)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。

TSB、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)、酵母浸粉(yeast extract,YE) 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、pH值校正緩沖溶液、乳酸(分析純) 南京化學(xué)試劑有限公司;Trizol試劑、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A、實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)試劑盒RR430A 大連寶生物工程有限公司;實(shí)驗(yàn)用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

2-16KL型高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司;HD-3A型水分活度測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司;GL-ZZM型高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司;DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZQTY-70型臺式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SG403A型生物安全柜 美國Baker公司;NANODROP-2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientific公司;ABI7500熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司;Mastercycler普通PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 鹽溶液制備及水分活度測定

正常TSB培養(yǎng)基中分別添加0、6、12、18 g/100 mL NaCl,高壓蒸汽滅菌后備用。按水分活度儀操作說明,將上述樣品置于25 ℃環(huán)境中平衡6 h,然后在該環(huán)境下用水分測量儀測量每組樣品的水分活度值,每組設(shè)3 個重復(fù),取平均值。

1.3.2 菌株活化和菌懸液制備

將-80 ℃冰箱保藏的3 株大腸桿菌O157:H7于TSA培養(yǎng)基劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h;挑取TSA平板中的單菌落于TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18～20 h(200 r/min),然后吸取1 mL菌液于100 mL TSB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h。

1.3.3 鹽應(yīng)激處理

取10 mL菌懸液,9 000×g、4 ℃離心5 min,去除上清液,沉淀用等體積PBS洗滌2 次,10 mLPBS重懸。吸取100 μL菌液于10 mL上述4 種TSB培養(yǎng)基中,渦旋均勻,初始菌量約為7(lg(CFU/mL))。靜置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中,分別于0、3、6、9、12、24、36、48 h和72 h取出,立即離心,沉淀用PBS洗滌重懸2 次,終止應(yīng)激。梯度稀釋后涂布于TSA-YE,37 ℃培養(yǎng)24 h平板計數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取平均值。

1.3.4 毒力基因表達(dá)測定

大腸桿菌O157:H7按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行鹽應(yīng)激處理,渦旋,靜置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)時間根據(jù)上述存活情況確定,離心洗滌,收集菌株沉淀,液氮速凍后,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA提取:按照試劑盒說明書提取菌體RNA,并用NANODROP 1000分光光度計檢測所提取的總RNA濃度和純度,使RNA樣本OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間。

反轉(zhuǎn)錄用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。為保證反轉(zhuǎn)錄效應(yīng),RNase-free DNase I去除基因組DNA。反轉(zhuǎn)錄體系為30 μL,其中6 μL PrimeScrept RT Master Mix,total RNA終質(zhì)量濃度50 ng/μL,RNase Free dH2O補(bǔ)足體積。反轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min;85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s;4 ℃,∞。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱長期保存。

real-time PCR用SYBR Premix ExTaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司),在real-time PCR儀上進(jìn)行。采用Primer Primer 6.0和Beacon designer軟件進(jìn)行熒光引物的設(shè)計,由生工生物工程(上海)有限公司負(fù)責(zé)引物的合成,引物序列如表1所示[19],用于擴(kuò)增大腸桿菌O157:H7的stx1、stx2、eae、hly4 種毒力基因,內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA基因。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)為:10 μL SYBR Premix ExTaq(2×),0.4 μL ROX Reference Dye II(50×),1.0 μL cDNA模板,上下游引物:各0.4 μL,7.8 μL RNase Free水。PCR程序:95 ℃預(yù)變性30 s(1 次循環(huán));95 ℃變性5 s,60 ℃退火和延伸34 s(40 個循環(huán));熔解:95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃、15 s(1 次循環(huán))。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequences and size of PCR amplification products

1.4 數(shù)據(jù)分析

菌株存活數(shù)用lg(CFU/mL)表示,熒光定量毒力基因相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實(shí)驗(yàn)均做3 次重復(fù)。采用SPSS V17.0 ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果顯著性使用Duncan多重比較檢驗(yàn),P＜0.05,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分活度

表2 不同NaCl添加量TSB培養(yǎng)基的水分活度Table 2 Water activity in TSB medium with different concentrations of salt

由表2可知,NaCl的添加降低了TSB培養(yǎng)基水分活度,且NaCl添加量越高,水分活度越低,添加12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl的TSB培養(yǎng)基水分活度顯著低于正常TSB培養(yǎng)基(P＜0.05)。

2.2 鹽應(yīng)激對大腸桿菌O157:H7存活的影響

由圖1A可知,當(dāng)TSB培養(yǎng)基添加一定量NaCl時,菌株CICC21530隨應(yīng)激時間延長存活菌數(shù)均逐漸下降,與正常TSB培養(yǎng)基(0 g/100 mL NaCl組)相比,NaCl添加量越高菌數(shù)下降越明顯,應(yīng)激36 h后18 g/100 mL NaCl組己檢測不出菌數(shù),顯著低于其他2 個TSB培養(yǎng)基加鹽組(P＜0.05)。由圖1B可知,各TSB培養(yǎng)基加鹽組菌株95的存活菌數(shù)隨時間延長低于正常TSB培養(yǎng)基組,其中18 g/100 mL NaCl組菌數(shù)逐漸呈下降趨勢,而其他2 個加鹽組呈現(xiàn)波動變化,應(yīng)激36 h后NaCl添加量越高存活菌數(shù)越低。由圖1C可知,各TSB培養(yǎng)基加鹽組菌株109的存活菌數(shù)隨時間延長低于正常TSB培養(yǎng)基組,3 個加鹽組均呈現(xiàn)波動變化,應(yīng)激36 h后6 g/100 mL NaCl組菌數(shù)顯著低于12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組。

綜合3 株大腸桿菌O157:H7存活情況,結(jié)果表明鹽應(yīng)激顯著抑制了細(xì)菌生長,但抑制效應(yīng)呈現(xiàn)明顯菌株差異。另外,不同NaCl添加量對3 株菌的影響亦不同,菌株CICC21530 NaCl添加量越高抑制越明顯,18 g/100 mL NaCl組抑制效應(yīng)最顯著,而其他兩株菌則呈現(xiàn)波動性變化。

圖1 大腸桿菌O157:H7不同NaCl添加量TSB培養(yǎng)基中的存活菌數(shù)Fig. 1 Survival curves of E. coli O157:H7 in TSB medium with different amounts of salt added

2.3 大腸桿菌O157:H7毒力基因表達(dá)情況

圖2 大腸桿菌O157:H7菌株CICC21530在不同NaCl添加量TSB培養(yǎng)基中應(yīng)激24 h的毒力基因表達(dá)水平Fig. 2 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain CICC21530 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

根據(jù)上述存活情況,應(yīng)激36 h的菌株CICC21530 18 g/100 mL NaCl組己檢測不出,其他兩株菌應(yīng)激過程中呈波動變化,故進(jìn)一步分析鹽應(yīng)激24 h的毒力基因表達(dá)情況。菌株CICC21530鹽應(yīng)激24 h后毒力基因表達(dá)情況如圖2所示。與正常TSB培養(yǎng)基(0 g/100 mL組)相比,應(yīng)激24 h的6 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組stx1表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05),而12 g/100 mL NaCl組無顯著差異;應(yīng)激24 h的12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組stx2表達(dá)量均顯著高于對照組(P＜0.05),6 g/100 mL NaCl組無顯著差異;鹽應(yīng)激組eae和hly表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05),且表達(dá)量隨NaCl添加量增加而增加。結(jié)果表明,鹽應(yīng)激導(dǎo)致菌株CICC21530四種毒力基因表達(dá)量普遍增加,但NaCl添加量不同對毒力基因的影響不完全一致,18 g/100 mL NaCl組4 種毒力基因表達(dá)量均顯著高于其他處理組。

由圖3可知,與對照組相比,應(yīng)激24 h的18 g/100 mL NaCl組stx1表達(dá)量顯著增加(P＜0.05),而6 g/100 mL和12 g/100 mL NaCl組顯著低于對照組(P＜0.05);18 g/100 mL NaCl組eae表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05),而6 g/100 mL和12 g/100 mL NaCl組無顯著變化。結(jié)果表明,菌株95鹽應(yīng)激24 h后,不同NaCl添加量對其毒力基因產(chǎn)生了不同的影響,18 g/100 mL NaCl組2 種毒力基因表達(dá)量均顯著高于其他處理組。

圖3 大腸桿菌O157:H7菌株95在不同NaCl添加量TSB培養(yǎng)基中應(yīng)激24 h的毒力基因表達(dá)水平Fig. 3 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain 95 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

圖4 大腸桿菌O157:H7菌株109在不同NaCl添加量TSB培養(yǎng)基中應(yīng)激24 h的毒力基因表達(dá)水平Fig. 4 Expression levels of virulence genes of E. coli O157:H7 strain 109 cultured in TSB medium with different concentrations of salt for 24 h

由圖4可知,與對照組相比,6 g/100 mL NaCl組無顯著性差異(P＞0.05),而12 g/100 mL和18 g/100 mL NaCl組eae和hly表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05),且12 g/100 mL NaCl組表達(dá)量最高。

綜合3 株大腸桿菌O157:H7毒力基因表達(dá)情況,結(jié)果表明鹽應(yīng)激對毒力基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響,不同NaCl添加量導(dǎo)致的影響不同;另外,不同菌株表達(dá)量的變化亦不完全一致,其中菌株CICC21530和菌株95于18 g/100 mL NaCl組各毒力基因表達(dá)量最高,而菌株109則于12 g/100 mL NaCl組毒力基因表達(dá)量最高。

進(jìn)一步綜合存活菌數(shù)和毒力基因表達(dá)兩方面,發(fā)現(xiàn)添加鹽顯著抑制了細(xì)菌存活,但毒力基因表達(dá)有加鹽組顯著增加,即相對毒性增強(qiáng)。另外不同NaCl添加量應(yīng)激時細(xì)菌存活和毒力基因表達(dá)存在菌株差異,18 g/100 mL NaCl組菌株CICC21530存活數(shù)顯著下降,但毒力基因的相對表達(dá)量反而顯著增加;其他兩株菌存活菌數(shù)呈波動性變化,菌株95的18 g/100 mL NaCl組表達(dá)量亦最高,菌株109卻是12 g/100 mL NaCl組表達(dá)量最高,表明鹽應(yīng)激時大腸桿菌O157:H7存活與毒力基因表達(dá)的變化不完全一致。

3 討 論

食鹽不僅是最重要的調(diào)味料,食品加工中添加鹽,通過降低水分活度還可抑制微生物,一直被廣泛用于食品保鮮,且普遍認(rèn)為高濃度鹽抑制效應(yīng)更好,能夠完全殺死或抑制污染的細(xì)菌生長[20-21]。鹽的添加造成微生物應(yīng)激反應(yīng),一方面,微生物都有其生長的最適水分活度,NaCl添加量增加導(dǎo)致水分活度降低,微生物生長速率也隨之下降;另一方面,NaCl添加量增加引起的滲透壓升高會導(dǎo)致水分子單方向從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)膜移動,造成細(xì)胞失水,影響微生物生長代謝[20,22]。關(guān)于鹽應(yīng)激對大腸桿菌O157:H7存活影響己有較多報道,Hosein等[23]指出LB肉湯中添加2%和4%的NaCl降低了大腸桿菌O157:H7的數(shù)量,但未對菌株產(chǎn)生完全致死效應(yīng)。Glass等[24]研究發(fā)現(xiàn)該致病菌在NaCl添加量為2.5%的TSB培養(yǎng)基中正常生長,但NaCl添加量為4.5%和6.5%時生長受到抑制,大于6.5%時(即8.5%和10.5%)無法生長。Stasic等[25]則發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在NaCl添加量12%的LB培養(yǎng)基中可以存活。本實(shí)驗(yàn)TSB培養(yǎng)基添加NaCl后3 株大腸桿菌O157:H7存活數(shù)均下降,但3 株菌下降程度不相同,18 g/100 mL加鹽組菌株CICC21530處理第36小時檢測不出,而其他2 株菌仍存活。上述不同研究報道表明NaCl對大腸桿菌O157:H7的抑制作用,與不同菌株、NaCl添加量及培養(yǎng)條件有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)鹽應(yīng)激過程中存活菌數(shù)有波動,且高質(zhì)量濃度NaCl添加組存活菌數(shù)并不一定低于低質(zhì)量濃度NaCl添加組,這與Osaili等[26]研究大腸桿菌O157:H7在含10%、15% NaCl奶酪鹽水中的存活情況相似。大腸桿菌O157:H7在鹽應(yīng)激環(huán)境中,可能通過自身滲透壓調(diào)控系統(tǒng)將應(yīng)激信息傳遞,激活相關(guān)酶和膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性,同時對特定基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)整,從而維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定,緩解應(yīng)激反應(yīng)[25,27-28]。

當(dāng)致病菌處于一種應(yīng)激環(huán)境時,會誘導(dǎo)一系列應(yīng)激反應(yīng),應(yīng)激反應(yīng)將會引起細(xì)菌生長動力學(xué)、營養(yǎng)代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、應(yīng)激反應(yīng)和毒力特性的變化[8,14,29],毒力特性的變化必將進(jìn)一步影響食品安全。關(guān)于食品中不同應(yīng)激環(huán)境對致病菌毒力的影響有不同報道,如:Elhanafi等[3]報道大腸桿菌在酸性培養(yǎng)基生長時增加了eaeA和hlyA基因表達(dá),但冷或冷-酸應(yīng)激對Stx2毒素量沒有影響。Huang等[30]指出酸應(yīng)激增加了大腸桿菌O157:H7菌株毒力特性。氧化應(yīng)激增加了大腸桿菌O157:H7毒力基因stx1和stx2表達(dá)水平,但對eae表達(dá)量無影響[31]。而熱休克大腸桿菌O157:H7與室溫對照組相比,多數(shù)毒力基因(stx1、stx2、hly等)表現(xiàn)為下調(diào)[19]。關(guān)于鹽應(yīng)激對產(chǎn)Stx大腸桿菌毒力特性影響報道中,Vero細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,產(chǎn)Stx大腸桿菌O157:H7接種香腸,發(fā)酵和干燥(pH 4.9,水分活度0.92)8 d增加了腸毒素(Stx1和Stx2)產(chǎn)生[32]。與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的滲透壓應(yīng)激(水分活度0.95～0.98)增加了non-O157菌株stx1、stx2和eae的mRNA表達(dá)水平,但對O157:H7菌株毒力影響不顯著[16]。Park等[33]轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示鹽應(yīng)激(0.6 mol/L NaCl)對大腸桿菌O157:H7 Stx相關(guān)基因表達(dá)均有下調(diào)作用。且Olesen等[14]結(jié)果表明,鹽應(yīng)激顯著增加了大腸桿菌O157:H7 EDL933菌株毒力基因表達(dá),但卻抑制了另外2 株STEC毒力基因表達(dá),存在菌株差異。因此鹽應(yīng)激可能影響菌株毒力基因的表達(dá),但研究報道不完全一致,分析原因可能是毒力變化情況與不同NaCl添加量等應(yīng)激條件、菌種、菌株有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,與對照組相比,鹽應(yīng)激24 h時,3 株菌株6 g/100 mL NaCl組毒力基因變化沒有明顯的規(guī)律,而菌株CICC21530、菌株95的18 g/100 mL NaCl組和菌株109的12、18 g/100 mL NaCl組均顯著高于其他各應(yīng)激組,即高鹽應(yīng)激時對菌株毒力有增強(qiáng)作用。致病菌相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能與鹽應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)[14,19],其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大腸桿菌O157:H7有毒菌株在含鹽食品中的存活及其毒力特性的增強(qiáng),將對食品安全造成潛在威脅。

4 結(jié) 論

鹽應(yīng)激顯著抑制大腸桿菌O157:H7的存活,抑制效應(yīng)與菌株、NaCl添加量有關(guān)。鹽應(yīng)激時大腸桿菌O157:H7毒力基因表達(dá)的變化也與菌株、NaCl添加量有關(guān),較高鹽量時,3 株菌存活數(shù)顯著降低的同時,毒力基因表達(dá)量卻顯著增加,即相對毒性增強(qiáng)。上述結(jié)果表明在實(shí)際含鹽食品風(fēng)險評估中,不僅要關(guān)注存活菌量,還需重視殘存菌的毒力水平,從而更科學(xué)全面地評估大腸桿菌O157:H7的安全風(fēng)險。