史素影，俞年軍△，彭代銀，張雨雷，朱 強(qiáng)，葛德助，馬 磊，Sven Schroder，韓榮春

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.亳州市皖北藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800；3.安徽普仁中藥飲片有限公司，安徽 亳州 236800；4.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800；5.漢堡大學(xué)附屬埃彭多夫醫(yī)院漢薩美安中醫(yī)中心，漢堡 埃彭多夫 20095）

毛莨科植物芍藥P.lactiflora Pall.的根，水煮去皮或去皮水煮后干燥作白芍藥用，味苦、酸、微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效[1]。亳州芍藥栽培歷史悠久，栽種品種是芍藥，花紅單葉，種植面積大，亳白芍為白芍道地藥材來(lái)源之一，在安徽省亳州市的各鄉(xiāng)鎮(zhèn)皆有種植。亳白芍色白粉足、產(chǎn)量亦大，于每年的九、十月份采挖，采收后的藥材經(jīng)產(chǎn)地初加工后銷往各地。白芍的加工需要去皮，關(guān)于去皮的處理，自古便有詳細(xì)記載，如張仲景的《金匱玉函經(jīng)》中有“刮去皮”[2]、《雷公炮制論》中有“以竹刀刮去粗皮并頭土”[3]、《本草圖經(jīng)》中有“采得刮凈去皮”[3]等。相關(guān)研究表明，芍藥根所含的化學(xué)成分主要包括單萜及其苷類化合物、三萜類化合物、黃酮類化合物、鞣質(zhì)（主要是以沒(méi)食子酸為基礎(chǔ)）、酚酸和多糖等[4-8]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道的具有相對(duì)明確藥理活性的成分有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、沒(méi)食子酰葡萄糖等[9-13]。一般芍藥根去皮處理除去的“皮”包括全部的栓皮部和少量的韌皮部，余下曬干的藥材由部分的韌皮部和全部的木質(zhì)部組成，“去皮”勢(shì)必會(huì)對(duì)化學(xué)成分產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響藥材的藥理作用。本文則把新鮮的亳白芍根的栓皮、韌皮和木質(zhì)部剝離，并建立HPLC特征圖譜，探討不同部位中化學(xué)成分的差異，為后期研究白芍赤芍不同功效主治的成因奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)，G1311X四元梯度泵，G1329自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315G二級(jí)管陣列檢測(cè)器）；CP225D型1/10萬(wàn)電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q Gradient A10超純水儀（密理博上海貿(mào)易有限公司）；AS30600BT系列超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

芍藥苷（批號(hào)X12ABC33672，純度≥98%）、氧化芍藥苷（批號(hào)P12N9S74762，純度≥98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)DST190120-071，純度≥98%）、苯甲酰芍藥苷（批號(hào)DST190719-053，純度≥98%）、沒(méi)食子酸（批號(hào) DST190715-08，純度≥98%）、苯甲酸（批號(hào)DST190609-001，純度≥98%）、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖（批 號(hào)DST190517-001，純度≥98%）購(gòu)于樂(lè)美天醫(yī)藥公司；乙腈（瑞典oceanpak，色譜純）；超純水、蒸餾水（自制）；磷酸（天津永大化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純）。

1.2 藥材 本實(shí)驗(yàn)所用芍藥根由課題組采挖于于安徽省亳州市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定皆為毛莨科植物芍藥P.lactiflora Pall.的根。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 白芍樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Topsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫 0～40 min，5%～50%A；40～41 min，50%～5%A；41～45 min，5%A；柱溫 30 ℃；流速 1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)脂苷、苯甲酰芍藥苷、沒(méi)食子酸、苯甲酸、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)照品適量，用甲醇配成含芍藥苷 1.1 mg·mL-1、氧化芍藥苷 0.6 mg·mL-1、芍藥內(nèi)脂苷 1.0 mg·mL-1、苯甲酰芍藥苷 0.6 mg·mL-1、沒(méi)食子酸 2.2 mg·mL-1、苯甲酸0.1 mg·mL-1、1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖 1.8 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取藥材粉末（過(guò)4號(hào)篩）約 10 mg，精密稱定，置 2 mL EP（eppendorf）管中，加50%乙醇1 mL，超聲處理30 min，取出，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以芍藥苷峰（峰4）為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12，24 h 按照 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以芍藥苷峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD均小于2.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以芍藥苷峰為參比峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的 RSD均小于2.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 特征圖譜建立 將18批樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，導(dǎo)出色譜圖。將栓皮部、韌皮部、木質(zhì)部樣品色譜圖分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版），進(jìn)行共有峰處理。S1、S7、S13自動(dòng)校正匹配，生成對(duì)照特征圖譜，分別得到3組樣品的特征圖譜，對(duì)照品圖譜、樣品疊加圖及特征圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品、樣品圖譜及特征圖譜

2.4.1 共有峰確認(rèn) 根據(jù)3組樣品的特征圖譜分析結(jié)果，栓皮部有15個(gè)共有峰，韌皮部有13個(gè)共有峰，木質(zhì)部有7個(gè)共有峰。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了7個(gè)特征峰，2號(hào)峰為沒(méi)食子酸，4號(hào)峰為氧化芍藥苷，6號(hào)峰為芍藥內(nèi)酯苷，7號(hào)峰為芍藥苷，8號(hào)峰為1，2，3，4，6-五沒(méi)食子酰葡萄糖，10 號(hào)峰為苯甲酸，12號(hào)峰為苯甲酰芍藥苷，其余峰對(duì)應(yīng)的化合物未知。

2.4.2 相似度分析 將18批樣品的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004版）軟件，對(duì)各圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。相似度結(jié)果分析表明，栓皮部組內(nèi)（S1～S6）相似度均不小于0.900、韌皮部組內(nèi)（S7～S12）相似度均不小于0.920、木質(zhì)部組內(nèi)（S13～S18）相似度均不小于0.994，說(shuō)明同一部位的化學(xué)成分類似；栓皮部與韌皮部的相似度位于0.841～0.974之間、栓皮部與木質(zhì)部的相似度介于0.586～0.766之間、韌皮部與木質(zhì)部的相似度在0.653～0.928之間，表明不同部位的化學(xué)成分有差異，栓皮部與木質(zhì)部的差異最大。

表2 樣品圖譜的相似度

2.4.3 聚類分析 將18批樣品按栓皮部的15個(gè)峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 23.0軟件進(jìn)行聚類分析（韌皮、木質(zhì)部無(wú)峰的峰面積記為0），以平方歐式距離為測(cè)量區(qū)間，采用質(zhì)心聚類的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[14]，見(jiàn)圖 2。18 批樣品被分成 3 類，S1、S6（栓皮部）未與S2、S3、S4、S5聚為一類；S13 ～ S18（木質(zhì)部）聚為一類，S2 ～S5（栓皮部）聚為一類，S7～S12（韌皮部）聚為一類。因此，除S1、S6外，聚類分析將栓皮、韌皮和木質(zhì)部分別聚為一類，其中栓皮和韌皮中化學(xué)成分較木質(zhì)部相近。因?qū)嶒?yàn)樣品的選取未控制藥材的栽培年限、生長(zhǎng)環(huán)境等的一致，各組內(nèi)圖譜存在差異，導(dǎo)致S1、S6不與栓皮組其余4個(gè)樣品聚為一類且栓皮組PCA得分差異大，可見(jiàn)生長(zhǎng)年限和環(huán)境條件對(duì)芍藥根化學(xué)成分的影響，由外向內(nèi)逐漸減弱。

圖2 聚類樹(shù)狀圖

2.4.4 主成分分析 將18批樣品的15個(gè)峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SPSS 23.0軟件進(jìn)行主成分分析，得出各共有峰方差貢獻(xiàn)表，見(jiàn)表3，15個(gè)峰中得出3種主成分，第1主成分貢獻(xiàn)率為70.82%，第2主成分貢獻(xiàn)率為12.26%，第3主成分貢獻(xiàn)率為8.42%，3種主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)91.50%。將樣品的15個(gè)峰峰面積導(dǎo)入 SIMCA-P（11.0）中，進(jìn)行主成分分析[15]，得到峰得分圖和樣品PCA得分圖，見(jiàn)圖3、圖4。由峰得分圖可知，6、10和7號(hào)峰為3個(gè)主成分峰，3個(gè)主要成分分別為芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酸。從樣品PCA得分圖可看出S13～S18即木質(zhì)部彼此靠近，S7～S12即韌皮部彼此靠近但較木質(zhì)部松散，S1～S6代表的栓皮部則最分散、彼此疏離，此結(jié)果與聚類分析一致。

圖3 峰得分圖

圖4 樣品PCA得分圖

表3 總方差解釋

2.4.5 主要成分含量測(cè)定 取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液用甲醇分別稀釋至 1/2、1/5、1/10、1/20、1/40 倍，得到6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定3次，求平均值，以對(duì)照品濃度（X）與峰面積（Y）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。由主成分分析可知，芍藥苷、芍藥內(nèi)脂苷和苯甲酸為主要成分，3個(gè)主要成分的線性關(guān)系見(jiàn)表4，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 3個(gè)主要成分的線性關(guān)系

將主要成分的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析，3個(gè)主要成分的含量在栓皮部、韌皮部和木質(zhì)部間兩兩比較，比較結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知：芍藥內(nèi)酯苷在栓皮部和韌皮部的含量沒(méi)有顯著性差異；芍藥苷在栓皮部、韌皮部和木質(zhì)部的含量均不存在顯著性差異；苯甲酸在栓皮部中的含量高于韌皮部，木質(zhì)部中含量極低。

表5 含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

圖5 不同部位主要成分的含量比較（**P<0.01）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC法得到了芍藥根栓皮部、韌皮部和木質(zhì)部的容易識(shí)別、分離度較好的特征圖譜，3個(gè)部分的特征圖譜顯示：栓皮部分離出 15個(gè)共有峰，韌皮部分離出 13個(gè)共有峰，木質(zhì)部分離出 7個(gè)共有峰。芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酸3個(gè)主要共有成分在各部分的分布情況并不像預(yù)期的那樣，在3個(gè)部位含量的從外向內(nèi)依次顯著遞減。但結(jié)合特征圖譜的共有峰數(shù)和樣品PCA圖來(lái)看，栓皮部提取液能分離出更多的成分且濃度稍高，木質(zhì)部提取液分離出的成分少且濃度較低，韌皮部則介于兩者之間。

本實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是亳州栽培芍藥的新鮮根，采挖后立即洗凈泥土，分取栓皮、韌皮和木質(zhì)部，藥材稍干后分取較困難。對(duì)于提取溶劑的選擇，文獻(xiàn)資料報(bào)道的主要有有乙醇-水、甲醇-水的不同比例，在這些研究的基礎(chǔ)上，筆者發(fā)現(xiàn)這些不同比例溶劑對(duì)成分的提取效率稍有差異，但對(duì)芍藥中常見(jiàn)成分提取的影響并不顯著，因此選用50%乙醇提??；流動(dòng)相與檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇，基于已有的文獻(xiàn)報(bào)道，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為230 nm；數(shù)據(jù)結(jié)果分析處理的方法亦參考了相似的文獻(xiàn)報(bào)道[16-20]。中藥白芍的加工中需去皮，一般去皮處理，除去的不僅有栓皮，還有少部分的韌皮。由含量測(cè)定結(jié)果可知，去皮與否對(duì)芍藥苷含量影響不大，對(duì)芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酸的含量影響較大，這或許是導(dǎo)致白芍、赤芍功效不同的原因之一。