孔令米 劉會 李俊雅 玄紅專

（聊城大學生命科學學院，聊城 252059）

蜂膠是蜜蜂從植物嫩芽和枝條的表面或傷口處采集的樹脂，再混合蜂蠟、花粉及自身分泌物質等形成的一種具有樹脂芳香味的天然活性物質。蜂膠中富含多種黃酮類、萜烯類和酚酸類等具有藥理活性的天然成分[1-3]，這些生物活性成分賦予蜂膠多種藥理學功能，例如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、免疫調節(jié)[4-6]等。

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，對全球人類健康造成嚴重威脅。盡管當前臨床治療方式多種多樣，但是肺癌的存活率仍然很低，多數(shù)病人死于遠端轉移，對人類健康危害極大[7]。蜂膠作為一種天然活性產(chǎn)物在抗腫瘤方面具有突出功效，且無明顯毒副作用。研究發(fā)現(xiàn)中國蜂膠中的黃酮類和酯類化合物具有明顯抗腫瘤功效[8]，具有非常好的應用價值。

本研究利用中國蜂膠及其主要組分（咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素）對兩種肺癌細胞A549和H1299的抗癌作用及機制進行了分析，為蜂膠的抗腫瘤活性研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國蜂膠產(chǎn)自山東省，主要膠源植物為楊樹。主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）（sigma公司）；Hoechst 33258、活性氧檢測熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）和線粒體膜電位熒光探針JC-1（美國Sigma公司）；抗體Caspase-3、PARP（美國Cell Signaling Technology）、β-actin（美國Santa Cruz Biotechnology）；其他試劑均為分析純。

A549、H1299細胞由本試驗所在實驗室保存。

1.2 試驗儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；TE2000S 倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus）；電泳儀和電轉儀（Bio-Rad公司）；MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂膠乙醇提取物（EECP）的制備

中國蜂膠來自山東省，主要膠源植物為楊樹。中國蜂膠經(jīng)冷凍、粉碎、95%（v/v）酒精浸提24h，減壓過濾，濾液經(jīng)40℃旋轉蒸發(fā)濃縮至恒重，放入-20℃冰箱中保存，使用時用95%酒精溶解。蜂膠中主要組分咖啡酸苯乙酯（CAPE）、白楊素、芹菜素、高良姜素均從蜂膠水提物中分離提純，并經(jīng)紫外光譜（UV）和核磁共振（NMR）鑒定，純度為98%以上[9]。

1.3.2 細胞培養(yǎng)

肺癌A549和H1299細胞均培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，孵育條件為：5% CO2、37℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3.3 細胞存活率的測定

將處于對數(shù)生長期的細胞按4000個/孔種植到96孔板，待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經(jīng)EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理48h后，棄細胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，然后用SRB染色10min，晾干，100mmol/l Tris堿溶解，在492nm處測吸光值。

細胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%

1.3.4 Hoechst33258染色

將處于對數(shù)生長期的A549和H1299細胞按4×104個/孔種植到24孔板中。待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經(jīng)EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養(yǎng)液，用1×PBS輕輕潤洗1次，加入Hoechst 33258工作液500μl，于CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。棄染色液，用1×PBS輕輕潤洗2次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 Transwell小室體外侵襲實驗

取對數(shù)生長期的A549和H1299細胞，消化，調整細胞密度到5×105/ml，transwell上室加入200μl細胞懸液，下室中加入600μl含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃孵育24h。用濕棉簽擦掉上室上面的Matrigel和非侵襲細胞，上室下面用0.1%結晶紫固定染色30min，高倍鏡下計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)。直徑上取4個視野，求其平均值。

1.3.6 活性氧（ROS）水平的檢測

將處于對數(shù)生長期的A549和H1299細胞按4×104個/ml種植到共聚焦小皿中。待細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經(jīng)EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗1次，加DCFH-DA應用液1ml，37℃孵育30min。棄DCFH-DA應用液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 線粒體膜電位檢測

將處于對數(shù)生長期的A549和H1299細胞按4×104個/ml種植到共聚焦小皿中。待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，處理組細胞分別經(jīng)EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h。棄細胞培養(yǎng)液，用1×PBS清洗，加JC-1染色液500μl，37℃孵育20min。棄JC-1染色液，用1×PBS漂洗3次，每次5min，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8 細胞蛋白提取及蛋白質免疫印跡（Western Blotting）

EECP（100μg/ml）及咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h后收集各組細胞，在RIPA裂解液中冰上裂解30min，用BCA法測定總蛋白濃度。取30~40μg總蛋白提取物上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1h，然后加入caspase 3、PARP和β-actin一抗稀釋液（1∶1000）于4℃冰箱孵育過夜。用1×PBST洗膜3次，每次5min；再加入二抗，室溫孵育1h，1×PBST洗膜3次，每次5min采用ECL顯色。Quantity One進行蛋白定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±S）表示，用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P < 0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 中國蜂膠及其主要組分對H1299細胞存活率的影響

前期我們已經(jīng)檢測了蜂膠及其主要組分對肺癌A549細胞存活率的影響[9]，蜂膠及其主要組分對H1299細胞存活率的影響如圖1-1、1-2和1-3所示。

由圖1可以看出，蜂膠及其主要組分CAPE、芹菜素、白楊素和高良姜素在24h和48h顯著抑制H1299細胞的增殖，且呈時間和劑量依賴性（*P<0.05，**P<0.01）。結合前期蜂膠及其主要組分對A549細胞的影響，可以看出蜂膠及其主要組分對兩種肺癌細胞均具有較好的抑制功效。

圖1-1 EECP在24h和48h對H1299細胞存活率的影響

圖1-2 蜂膠中主要組分在24h對H1299細胞存活率的影響

圖1-3 蜂膠中主要組分在48h對H1299細胞存活率的影響

2.2 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞侵襲的影響

腫瘤細胞的侵襲和轉移是腫瘤治療中的難點。由圖2可以看出，EECP及蜂膠主要組分處理A549和H1299細胞24h后，顯著抑制兩種腫瘤細胞的侵襲，且咖啡酸苯乙酯、白楊素和芹菜素效果尤為顯著。

圖2 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞侵襲的影響

2.3 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡的影響

前期我們已經(jīng)證明蜂膠及其主要組分能顯著抑制多種腫瘤細胞增殖[9]。經(jīng)Hoechst33258染色可以看出，兩種肺癌細胞（A549和H1299）經(jīng)EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）分別處理24h后，細胞數(shù)量減少，細胞凋亡顯著上升，且細胞核出現(xiàn)顯著的核染色質濃縮和破裂現(xiàn)象（圖3）。

圖3 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡的影響

2.4 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞凋亡蛋白表達的影響

Caspase酶家族在凋亡信號傳導過程中發(fā)揮關鍵作用[10]。PARP剪切被認為是細胞凋亡的另一個重要指標，也通常被認為是Caspase-3激活的指標。EECP（100μg/ml）和咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素、高良姜素（80μM）對PARP和caspase 3的影響如圖4所示。在A549和H1299兩種細胞中，蜂膠及其主要組分顯著上調凋亡執(zhí)行者caspase 3的水平，而未剪切的PARP水平顯著降低（*P<0.05，**P<0.01）。

圖4 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中PARP、Caspase 3蛋白表達的影響

2.5 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中ROS水平的影響

細胞內ROS過多積累，在細胞凋亡、分化和增殖中發(fā)揮重要作用[11]。由圖5可以看出，H1299細胞經(jīng)中國蜂膠及其主要組分處理24h后，ROS水平顯著上調，但在A549細胞中，咖啡酸苯乙酯對ROS水平影響不顯著，其他幾種組分如白楊素、芹菜素和高良姜素及EECP顯著上調ROS的水平（*P<0.05，**P<0.01）。

圖5 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞中ROS水平的影響

2.6 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞內線粒體膜電位的影響

細胞內ROS過多積累會引起線粒體的損傷，導致線粒體膜電位的下降。線粒體膜電位的下降出現(xiàn)在細胞形態(tài)學改變之前，是凋亡的早期表現(xiàn)[12]。本研究采用線粒體膜電位熒光探針JC-1，通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化，結果如圖6所示。在H1299細胞中，EECP對線粒體膜電位影響較顯著，其他組分如白楊素和芹菜素對A549細胞中線粒體膜電位影響不顯著。在H1299細胞中蜂膠及其主要組分顯著降低線粒體膜電位水平（*P<0.05，**P<0.01）。

圖6 中國蜂膠及其主要組分對A549和H1299細胞內線粒體膜電位的影響

3 討論

肺癌是一種惡性腫瘤，嚴重危害人體健康。盡管肺癌治療手段不斷進步，總體生存率、生存期不斷延長，但肺癌治療成本仍較高。蜂膠是一種藥用價值較高的天然產(chǎn)物，具有較好的抗腫瘤功效，對多種腫瘤具有顯著的抑制功效。

肺癌轉移是肺癌的惡性標志和生物學特征，也是導致肺癌病人治療失敗和死亡的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)中國蜂膠乙醇提取物及其主要組分咖啡酸苯乙酯、白楊素、芹菜素和高良姜素顯著抑制兩種肺癌細胞A549和H1299的侵襲和浸潤，表明了蜂膠及其主要組分抑制肺癌轉移的潛在功效。此外，蜂膠及其主要組分顯著促進兩種肺癌細胞的凋亡，其促凋亡效果與蜂膠及其主要組分能夠活化促凋亡基因，促進細胞內活性氧的積聚，破壞線粒體膜電位進而誘導肺癌細胞凋亡有關。

蜂膠的化學成分非常復雜，從兩種肺癌細胞的抑制功效可以看出蜂膠藥效體現(xiàn)的是綜合效應和整體療效，蜂膠整體藥效的發(fā)揮不是單一成分藥效的簡單疊加，而是存在著復雜的相互作用和協(xié)同功效[13]。蜂膠的抗腫瘤作用機理也很可能是多網(wǎng)絡、多靶點的[14]，蜂膠抑制肺癌細胞增殖是否對其他信號通路及其靶點發(fā)揮功效還需要進一步發(fā)掘、研究。