楊 夢,王 鵬,袁 輝,劉曉青,徐曉倩,熊長輝,黃星魁,段 然,王 鑫

小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica,Y.e)是一種在自然界以豬、嚙齒動物等動物為宿主并分布廣泛的一種人獸共患病病原菌。該菌通過被污染的食物、水，經糞口或與動物接觸感染，引起一系列消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和全身疾病。為了解江西地區(qū)小腸結腸炎耶爾森菌在宿主動物的分布和病原特征，本研究采集了2011-2016年豬咽拭子及腸內容物，鼠盲腸部內容物及舌根部標本，進行小腸結腸炎耶爾森菌的分離培養(yǎng)及鑒定，同時對篩選出的小腸結腸炎耶爾森菌進行血清分型、生物分型、相關毒力基因檢測及脈沖場凝膠電泳，為預防江西地區(qū)小腸結腸炎耶爾森菌傳播提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本 采集2011-2013年在江西省生豬屠宰場的生豬咽拭子202份、肛拭子100份；采集2013-2016年江西省鼠疫監(jiān)測點的鼠盲腸部內容物及舌根部標本各358份，其中包括2013年采集的標本270份，2014年采集的標本54份，2016年采集的標本34份，2015年未采集標本。

1.2試劑及儀器 細菌的分離培養(yǎng)選用美國BD公司的耶爾森菌選擇性培養(yǎng)基(Yersinia selective ager)及其配套抗生素及英國OXOID公司的哥倫比亞營養(yǎng)瓊脂；細菌的菌種鑒定選用法國生物梅里埃公司(bioMérieux, France)的Api 20E生化鑒定條及其配套試劑；小腸結腸炎耶爾森菌的分型血清選用日本生研株式會社的分型血清試劑(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)；酶切、電泳及成像分別選用TaKaRa公司的NotⅠ、蛋白酶K，Cambraex Bio Science Rockland公司的瓊脂糖SeaKem Gold Agarose及美國Bio-Rad公司的CHEF Mapper XA脈沖場凝膠電泳儀和GEL Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方 法

1.3.1菌株分離培養(yǎng)和鑒定 將采集生豬的咽拭子、回盲腸部位標本及嚙齒動物的舌根部、回盲腸部位標本以1∶10的比例接種于改良PBS增菌液中，放至4 ℃冷增菌21 d后的增菌液上下顛倒混勻后，提取細菌DNA，利用PCR擴增檢測foxA保守基因。將PCR結果為foxA陽性的標本接種于小腸結腸炎耶爾森菌選擇性平板(CIN)，25 ℃培養(yǎng)24～48 h,挑取菌落形態(tài)疑似“公牛眼”狀(細菌的菌落中心為深紅色，外周有一環(huán)呈無色透明)的菌落, 接種于克氏雙糖斜面25 ℃培養(yǎng)24 h。挑選克氏雙糖斜面表現(xiàn)為：葡萄糖、乳糖陽性、不產氣、H2S陰性的菌落，接種于尿素培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基，選擇尿素酶陽性，25 ℃培養(yǎng)動力陽性、37 ℃培養(yǎng)動力陰性，革蘭染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌或橢圓或球桿菌細菌，用Api 20E生化板條28 ℃培養(yǎng)48 h，進行細菌生化的鑒定。

1.3.2血清學分型 本研究采用玻片凝集法進行血清分型(O∶3、O∶5、O∶8、O∶9)。選擇少量純培養(yǎng)的細菌，用生理鹽水制成細菌懸液，通過研磨分型血清觀察有無凝集顆粒形成，同時以生理鹽水自凝作為對照。

1.3.3生物分型 將純培養(yǎng)的小腸結腸炎耶爾森菌菌株按參考文獻[1]的方法進行生物分型。

1.3.4DNA提取及毒力基因PCR檢測 用細菌基因組DNA提取試劑盒，參照說明書步驟，從標本增菌液中提取標本的全基因組DNA。將鑒定分離到的79株小腸結腸炎耶爾森菌，進行6種毒力基因(ystA、ystB、yadA、virF、ail和rfbc)的PCR擴增，引物序列見參考文獻[2]。采用50 μL PCR體系對提取的核酸進行擴增。體系如下：10×buffer 5 μL，上下游引物各1 μL，dNTPs終濃度0.2 mmol/L，模板DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶(BioAsia)0.5 μL(5 u/μL)，無菌水補齊至50 μL。

1.3.5脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型分析 按照國家致病菌識別網標準化操作程序，主要參數(shù)如下：調整細菌懸液濃度至3.8-4.2 MCF；使用45 UNotI進行酶切；電泳脈沖時間：2～20 s；電泳時間：18 h。將PFGE圖像錄入到BioNumerics(Version 5.10，Applied maths公司，比利時)軟件包識別圖像條帶，用Dice系數(shù)(Dice coefficients,SD)表示每兩個圖像之間的相似性系數(shù)。采用非加權配對算術平均法(unweighted pair group average method, UPGMA)進行聚類分析，并構建聚類樹。

2 結 果

2.1標本分離結果 在2011-2016年間，本研究采集豬和鼠的標本共1 018份，分離到小腸結腸炎耶爾森菌79株，陽性率為7.76%(79/1 018)。

2.1.1生豬攜帶情況 2011-2013年采集豬咽拭子共202份，分離到小腸結腸炎耶爾森菌61株，陽性率為30.20%(61/202)，采集豬肛拭子100份，分離到2株小腸結腸炎耶爾森菌，陽性率為2.0%(2/100)。其中2011 年采集102份豬咽拭子標本，分離到小腸結腸炎耶爾森菌56株，陽性率為54.90%(56/102)；2013年采集100份豬咽拭子標本，分離到小腸結腸炎耶爾森菌5株，相對應的100份肛拭子標本，分離到小腸結腸炎耶爾森菌2株。見表1。

2.1.2鼠攜帶情況 2013-2016年采集鼠盲腸部內容物及舌根部標本共716份，其中鼠盲腸部內容物標本358份，分離到14株小腸結腸炎耶爾森菌，陽性率為3.91%(14/358)，鼠舌根部標本358份，分離到2株小腸結腸炎耶爾森菌，陽性率0.56%(2/358)。見表1。

2013年鼠盲腸部內容物及舌根部標本共540份，其中盲腸部內容物標本分離到7株小腸結腸炎耶爾森菌，舌根部標本未分離到小腸結腸炎耶爾森菌；2014年鼠盲腸部內容物及舌根部標本共108 份，其中盲腸部內容物標本分離到6株小腸結腸炎耶爾森菌，舌根部標本分離到2株小腸結腸炎耶爾森菌；2016年鼠盲腸部內容物及舌根部標本共68 份，其中盲腸部內容物標本分離到1株小腸結腸炎耶爾森菌，舌根部未分離到小腸結腸炎耶爾森菌。

表1 2011—2016年豬、鼠標本中小腸結腸炎耶爾森菌分離情況Tab.1 Isolation of Yersinia enterocolitica from pigs and mice in 2011-2016

2.2菌株血清型、生物型結果 對79 株小腸結腸炎耶爾森菌進行血清分型和生物分型，發(fā)現(xiàn)有3種血清型(O∶3、O∶5以及O∶8)及2種生物型(1A型和3型)；其中63株豬標本分離株血清分型均為O∶3血清型，生物分型62株為生物3型，1株不能分生物型；16株鼠標本分離株中，有3株O∶5血清型菌株，生物型全為 1A 型；有1株O∶8血清型菌株，其生物型為 1A型；未分型菌株共有12株，生物型均為1A型,見表2。

2.3菌株毒力基因檢測結果 對79株小腸結腸炎耶爾森菌的6個基因(ystA、ystB、ail、yadA、rfbc、virF)進行PCR檢測，結果顯示,在63株O∶3血清型菌株中，59株攜帶ystA、yadA、virF、ail、rfbc基因，4株攜帶ystA、ail、rfbc基因；有12株攜帶ystB基因，其他的4株菌均為陰性,見表2。

表2 79株小腸結腸炎耶爾森菌血清型、生物型和毒力基因型別及檢測結果Tab.2 Serotypes, biotypes and virulence genotypes and distribution of 79 strains of Yersinia enterocolitica

2.4 PFGE分型結果

2.4.1致病性菌株PFGE分型結果 使用NotI內切酶對O∶3血清型的63株小腸結腸炎耶爾森菌進行酶切，并進行PFGE分型分析。結果顯示，帶型相似系數(shù)為90%～100%，可分為K6GN11-C30021、K6GN11C30012、K6GN11C30098、K6GN11-C30061、K6GN11C300100、K6GN11C30059 6種帶型，以 K6GN11C30021為主要型別，占所有菌株的80.95%(51/63)。見圖1A。

2.4.2非致病性菌株PFGE分型結果 使用NotI內切酶對1A生物分型的16株小腸結腸炎耶爾森菌進行酶切，并進行PFGE分型，結果表示，帶型相似系數(shù)在70%～100%，可分為15種PFGE帶型。見圖1B。

3 討 論

通過對1 018份豬、嚙齒動物宿主標本進行核酸檢測，總檢出率為7.76%(79/1 018)，初步了解江西省以生豬、嚙齒動物為宿主的小腸結腸炎耶爾森菌的檢出情況。生豬、嚙齒動物檢出率分別為20.86%(63/302)、2.24%(16/716)，提示生豬可能為小腸結腸炎耶爾森菌的主要宿主，與國內外監(jiān)測結果一致[3]。豬咽拭子的檢出率為30.20%(61/202),豬肛拭子的陽性率為2.0%(2/100)，這一結果表示，豬的扁桃體帶菌率可能高于豬的回盲部內容物帶菌率。

不同宿主動物的分離株的血清型和生物型差異較大。在生豬標本中，63株分離株均為致病性O∶3血清型，其中有62株是生物3型，有1株不能分生物型；在鼠標本中，16株為非致病性血清型O∶5、O∶8和某些未分型菌株，以1A型生物型為主。據(jù)此分析，對于存在不同血清型和生物型的小腸結腸炎耶爾森菌，動物的易感性不同：豬對致病性菌株的易感性較高，而嚙齒動物對非致病性菌株的易感性較高。

毒力基因檢測結果表明，目前被認為是小腸結腸炎耶爾森菌位于染色體上的重要毒力基因ystA在63株O∶3血清型菌株中均可檢測到，其與菌株的致病性相關。本次監(jiān)測中帶有ystA基因的菌株主要來源于生豬，提示生豬可能在小腸結腸炎耶爾森菌的流行、傳播與致病中起到重要作用。而16株生物1A型的菌株中，除12株攜帶ystB基因外，其他毒力基因檢測均為陰性。一般認為，生物1A型為非致病性菌株，而攜帶ystB基因的生物1A型菌株與人類腹瀉有顯著的流行病學關聯(lián)，可能對人類健康構成危害[4-5]。由此提示，應該提高對嚙齒動物中非致病性生物1A型小腸結腸炎耶爾森菌的警惕性，防范其對該區(qū)域居民造成健康危害。

A

BA為63株O∶3血清型小腸結腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖 B為16株生物l A型小腸結腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖圖1 小腸結腸炎耶爾森菌PFGE分型聚類圖Fig.1 PFGE cluster tree of Yersinia enterocolitica strains

近年來，PFGE作為分子分型的“金標準”，穩(wěn)定性好、敏感性高，被廣泛用于菌株的遺傳關系的研究中[6-7]。63株血清型為O∶3型的致病性菌株可分為6個帶型，以K6GN11C30021為主要類型，聚類相似性較高，優(yōu)勢型顯著，占80.95%(51/63)。K6GN11C30021這種帶型與河南、江蘇、寧夏回族自治區(qū)、內蒙古自治區(qū)、青海和四川分離株的帶型一致，與北京、天津和云南分離株帶型不一樣(K6GN11C30012)。與致病性小腸結腸炎耶爾森菌的分型特點存在差異的是，16株生物1A型的非致病性菌株可分為15種PFGE帶型，其總體聚類相似性比較低，遺傳一致性不高，個體間的帶型差異較大，呈現(xiàn)多元化流行趨勢。

小腸結腸炎耶爾森菌作為一種在自然界以多種動物為宿主并分布廣泛的人獸共患病病原菌，已發(fā)現(xiàn)有30多種動物攜帶小腸結腸炎耶爾森菌[8]。其宿主生豬，尤其是豬咽拭子中，分離率較高[9]。本研究中生豬咽拭子分離結果也進一步證實，生豬可能是小腸結腸炎耶爾森菌的某些致病性菌株的主要宿主,這大大增加了豬養(yǎng)殖和加工的從業(yè)人群的感染風險。因此，該地區(qū)應加強生豬中小腸結腸炎耶爾森菌的監(jiān)測，降低其在豬體內的的感染風險，控制小腸結腸炎耶爾森菌的傳播。

利益沖突：無