宮 強, 阮夢蝶，郭潔真，杜珍奇

銅綠假單胞菌是一種臨床常見的條件致病性人獸共患病原菌。該菌感染人后可引起肺炎、腦膜炎及尿路感染等多種疾病[1-2]。此外，該菌還可導致禽類、水貂等多種動物發(fā)生出血性肺炎及敗血癥等[3]。目前該菌引起的相關疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢[4]，給人類和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來了一定的威脅。對于該病的防治臨床上主要采用藥物治療，尤其是抗生素效果較好，但隨著抗生素的大量應用，該病原菌的耐藥性問題日益嚴重，已對多種抗生素產(chǎn)生了較為嚴重的耐藥性[5-7]。因此急需尋求更加有效的措施來控制該病原菌。

眾所周知，免疫預防是控制傳染病的重要舉措。目前不乏有關于銅綠假單胞菌疫苗的研究報道，然而臨床上仍無可用的商品化疫苗[8]，因此，銅綠假單胞菌新型疫苗的研制勢在必行。DNA疫苗自上世紀90年代問世以來，因其具有制備簡單、易于保存等優(yōu)點而備受研究者的關注。本課題組前期以銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因構建了單價、二價融合和二價組合DNA疫苗，研究了其在雞和小鼠體內的免疫效果，結果均顯示二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF可為實驗動物提供較好的免疫應答和保護效果[9-10]。基于此，本實驗對該組合DNA疫苗設置了不同的免疫劑量，并評估了各劑量在小鼠體內誘導的免疫應答水平和為小鼠提供的保護效果，為進一步優(yōu)化該組合DNA疫苗的接種程序奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1菌種、質粒與動物 銅綠假單胞菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。真核質粒pcDNA3.1(+)為本實驗室保存。健康的6～8周齡 BALB/c小鼠購自河南科技大學醫(yī)學技術與工程學院。

1.2主要試劑 羊抗鼠HRP-IgG為諾唯贊生物科技公司產(chǎn)品；限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；小鼠IL-2和IFN-γ ELISA檢測試劑盒為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3DNA疫苗的構建 按照前期的方法構建DNA疫苗，PCR擴增銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因，以限制性內切酶EcoRⅠ/BamHⅠxia酶切后連接pcDNA3.1(+)，轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，隨后挑菌提質粒并進行酶切鑒定，重組質粒分別命名為pOPRL和pOPRF，將兩者以等濃度等比例混合后獲得二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF。

1.4小鼠免疫 健康的6-8周齡 BALB/c小鼠共210只飼養(yǎng)于動物房中，給予合適的光照、溫度、濕度和自由飲食，待其適應環(huán)境后隨機平均分為6組，每組35只小鼠，分別命名為 25 μg組、50 μg組、100 μg組、200 μg組、pcDNA3.1(+)組和PBS組。大量制備pOPRL+pOPRF以及空載體pcDNA3.1(+)，以pH 7.2的1×PBS調整至1 μg/μL后進行免疫。各疫苗組的小鼠分別給予肌肉免疫相應劑量的pOPRL+pOPRF疫苗，空載體pcDNA3.1(+)組和PBS組的每只小鼠則分別予以肌肉注射100 μL的pcDNA3.1(+)和pH 7.2的1×PBS。各組小鼠均進行3次免疫，每次間隔2周。

1.5血清特異性抗體的測定 從第1次免疫后1周時開始對各免疫組的小鼠進行斷尾采血，離心分離血清后以間接ELISA法測定血清特異性抗體水平，總共檢測6周。以提取的銅綠假單胞菌的外膜蛋白為抗原包被酶標板，包被濃度為20 μg/mL。隨后以5%的BSA封閉2 h，再加入1∶100稀釋的待測血清，37 ℃反應1.5 h。再經(jīng)PBST洗滌后加入HRP標記的山羊抗鼠IgG，反應1.5 h后加入OPD在暗室中顯色10 min，以2 mol/L的硫酸終止反應，酶標儀測定OD492nm的值。

1.6免疫小鼠脾淋巴細胞增殖分析 每次免疫2周后按文獻方法制備免疫小鼠的脾淋巴細胞懸液，MTT法測定其增殖水平[11]。每組取5只小鼠，脫頸處死后無菌分離制備脾淋巴細胞懸液，將細胞濃度調整為1×107個/mL。取50 μL脾淋巴細胞懸液加于96孔細胞培養(yǎng)板中，并設陰性對照。隨后向試驗孔中加入20 μg/mL的銅綠假單胞菌的外膜蛋白50 μL，陰性對照孔則加入50 μL的細胞培養(yǎng)液。將細胞培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱中反應72 h后取出，然后向每個反應孔中加入10 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)放置于在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結束后離心棄掉上清液，然后向每孔中加入150 μL的 DMSO，在37 ℃培養(yǎng)箱內放置10 min后測定OD570 吸光值，按下述公式計算刺激值(SI)=OD(試驗孔)/OD(陰性對照孔)。

1.7細胞因子分泌水平測定 每次免疫后2周時按照上述方法制備各免疫組小鼠的脾臟淋巴細胞懸液，用銅綠假單胞菌外膜蛋白刺激后在5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，離心后取培養(yǎng)上清液，以小鼠IFN-γ和IL-2檢測試劑盒測定2種細胞因子的濃度。

1.8攻毒實驗 3免2周后以銅綠假單胞菌強毒菌株對各免疫組剩余的20只小鼠進行腹腔攻毒，攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察15 d，每天記錄小鼠死亡情況，實驗結束后根據(jù)各組的死亡情況繪制小鼠的存活曲線，并計算各免疫組的保護率。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SAS 9.4統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，各免疫組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α為0.05。

2 結 果

2.1重組質粒pOPRL和pOPRF的鑒定 PCR擴增銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因，連接真核載體pcDNA3.1(+)后以限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，如圖1所示，經(jīng)酶切后獲得大小約為517 bp和1 063 bp的DNA片段，表明重組質粒pOPRL和pOPRF構建成功。

M為 DNA Marker DL2000， A-1和B-1分別為pOPRL和pOPRF雙酶切鑒定結果圖1 重組質粒pOPRL和pOPRF雙酶切鑒定Fig.1 Electrophoresis of the two enzymes digestion of pOPRL and pOPRF

2.2免疫小鼠血清抗體水平 間接ELISA測定各免疫組小鼠血清抗體水平，結果如圖2所示。隨著免疫次數(shù)的增加，各劑量組免疫小鼠的血清特異性抗體水平均逐漸上升，且高于兩對照組(F=15.326，P<0.01)。2免和3免后，100 μg和200 μg免疫組的血清抗體水平高于25 μg和50 μg免疫組(F=8.139，P<0.05)，但100 μg和200 μg免疫組之間無統(tǒng)計學差異(F=1.662，P>0.05)。

圖2 各免疫組小鼠血清抗體水平檢測結果Fig.2 Dynamic changes of serum antibody levels in vaccinated mice

2.3脾淋巴細胞增殖檢測結果 每次免疫2周時制備免疫小鼠脾淋巴細胞，以銅綠假單胞菌外膜蛋白進行誘導后，MTT法測定其增殖情況。如圖3，免疫后各劑量二價組合DNA疫苗組的SI值始終高于pcDNA3.1(+)組和PBS組(F=13.477，P<0.01)。初次免疫后各劑量組的SI之間無統(tǒng)計學差異(F=0.862，P>0.05)，2免和3免后100 μg和200 μg免疫組的SI值則與25 μg和50 μg免疫組之間呈現(xiàn)出明顯的差異(F=7.419，P<0.05)。雖然2免和3免后100 μg組的SI值稍高于200 μg組，但差異無統(tǒng)計學意義(F=1.107，P>0.05)。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細胞增殖水平Fig.3 Splenic lymphocytes proliferation in vaccinated mice

2.4細胞因子檢測結果 每次免疫2周時制備銅綠假單胞菌外膜蛋白刺激的脾淋巴細胞懸液，測定其分泌的IFN-γ和IL-2的濃度。如圖4所示，每次免疫后各免疫劑量組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ和IL-2的濃度始終高于兩組對照組(F=17.355，P<0.01)。第一次免疫后，各劑量組分泌的IFN-γ和IL-2的量無統(tǒng)計學差異(F=0.751，P>0.05)，而2免和3免后100 μg和200 μg免疫組兩種細胞因子的濃度明顯高于25 μg和50 μg免疫組(F=9.684，P<0.05)，且在3免后100 μg組小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ和IL-2高于200 μg免疫組(F=6.375，P<0.05)。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ(A)和IL-2(B)濃度Fig.4 Concentrations of IFN-γ (A) and IL-2 (B) from spleen lymphocytes of vaccinated mice

2.5動物攻毒試驗結果 第3次免疫后以銅綠假單胞菌強毒株進行攻毒，記錄各組小鼠的死亡時間。如圖5所示，攻毒后pcDNA3.1(+)組和PBS組的小鼠迅速死亡，存活時間均未超過5 d。25 μg和50 μg免疫組的小鼠在攻毒后第2 d開始出現(xiàn)死亡，至第15 d時其存活數(shù)分別為7只和9只。100 μg和200 μg免疫組的小鼠在攻毒后第3 d出現(xiàn)死亡，分別于攻毒后第5 d和第6 d開始死亡數(shù)量不再增加，保持為17只和14只。因此，25 μg、50 μg、100 μg和200 μg的銅綠假單胞菌二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF為小鼠提供的保護率分別為35%、45%、85%和70%。

圖5 攻毒后各組小鼠存活情況Fig.5 Survival curve of vaccinated mice after challenge

3 討 論

銅綠假單胞菌是一種可導致人類和多種動物疾病的常見人獸共患病原菌，由于其耐藥性的日益嚴重和可用商品化疫苗的缺乏給該病原菌引起的相關疾病的臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，因此需加大對該病原菌有效疫苗的研究開發(fā)。目前國內外對于其相關疫苗的研究不在少數(shù)，包括滅活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、結合疫苗等在內的都有相關研究報道[12-16]。本課題組前期以銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因構建了多種DNA疫苗，動物實驗結果顯示二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF具有較好的應用前景，為進一步提高其免疫效果，本實驗對其最佳免疫劑量進行了探索。

抗體應答在抗感染免疫中發(fā)揮著重要的作用，本實驗檢測了各劑量的pOPRL+pOPRF誘導的血清抗體水平，結果表明高劑量的二價組合DNA疫苗誘導體液免疫應答的能力優(yōu)于低劑量。除抗體應答外，本實驗也對各劑量DNA疫苗誘導的細胞免疫應答水平進行了檢測，淋巴細胞增殖試驗和細胞因子分泌試驗是衡量細胞免疫水平較為常用方法[17]。本實驗以銅綠假單胞菌外膜蛋白為特異性刺激物用以誘導各免疫組小鼠的脾淋巴細胞，與抗體檢測結果相似，高劑量組免疫小鼠脾淋巴細胞的增殖能力優(yōu)于低劑量組。本實驗的前期研究顯示二價組合DNA疫苗可誘導較強的Th1型免疫應答，而其誘導的Th2型免疫應答并不優(yōu)于單價DNA疫苗和二基因融合DNA疫苗[9]。因此，本實驗僅對不同劑量的pOPRL+pOPRF誘導的Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2進行了測定，結果表明當免疫劑量為100 μg時其誘導免疫小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-γ和IL-2濃度高于其他各劑量組。攻毒實驗結果亦顯示100 μg的pOPRL+pOPRF可為小鼠提供高于其他劑量的保護效果。因此，本實驗研究結果表明銅綠假單胞菌二價組合DNA疫苗在小鼠體內誘導的免疫效果及為小鼠提供的保護效果與免疫劑量有一定的相關性，但并非越高越好，對小鼠而言最佳免疫劑量為100 μg/只。

利益沖突：無