宮 強(qiáng), 阮夢蝶，郭潔真，杜珍奇

銅綠假單胞菌是一種臨床常見的條件致病性人獸共患病原菌。該菌感染人后可引起肺炎、腦膜炎及尿路感染等多種疾病[1-2]。此外，該菌還可導(dǎo)致禽類、水貂等多種動物發(fā)生出血性肺炎及敗血癥等[3]。目前該菌引起的相關(guān)疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢[4]，給人類和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展帶來了一定的威脅。對于該病的防治臨床上主要采用藥物治療，尤其是抗生素效果較好，但隨著抗生素的大量應(yīng)用，該病原菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重，已對多種抗生素產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的耐藥性[5-7]。因此急需尋求更加有效的措施來控制該病原菌。

眾所周知，免疫預(yù)防是控制傳染病的重要舉措。目前不乏有關(guān)于銅綠假單胞菌疫苗的研究報道，然而臨床上仍無可用的商品化疫苗[8]，因此，銅綠假單胞菌新型疫苗的研制勢在必行。DNA疫苗自上世紀(jì)90年代問世以來，因其具有制備簡單、易于保存等優(yōu)點而備受研究者的關(guān)注。本課題組前期以銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因構(gòu)建了單價、二價融合和二價組合DNA疫苗，研究了其在雞和小鼠體內(nèi)的免疫效果，結(jié)果均顯示二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF可為實驗動物提供較好的免疫應(yīng)答和保護(hù)效果[9-10]。基于此，本實驗對該組合DNA疫苗設(shè)置了不同的免疫劑量，并評估了各劑量在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平和為小鼠提供的保護(hù)效果，為進(jìn)一步優(yōu)化該組合DNA疫苗的接種程序奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒與動物 銅綠假單胞菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為本實驗室保存。健康的6～8周齡 BALB/c小鼠購自河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院。

1.2主要試劑 羊抗鼠HRP-IgG為諾唯贊生物科技公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；小鼠IL-2和IFN-γ ELISA檢測試劑盒為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3DNA疫苗的構(gòu)建 按照前期的方法構(gòu)建DNA疫苗，PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因，以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠxia酶切后連接pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，隨后挑菌提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，重組質(zhì)粒分別命名為pOPRL和pOPRF，將兩者以等濃度等比例混合后獲得二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF。

1.4小鼠免疫 健康的6-8周齡 BALB/c小鼠共210只飼養(yǎng)于動物房中，給予合適的光照、溫度、濕度和自由飲食，待其適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)平均分為6組，每組35只小鼠，分別命名為 25 μg組、50 μg組、100 μg組、200 μg組、pcDNA3.1(+)組和PBS組。大量制備pOPRL+pOPRF以及空載體pcDNA3.1(+)，以pH 7.2的1×PBS調(diào)整至1 μg/μL后進(jìn)行免疫。各疫苗組的小鼠分別給予肌肉免疫相應(yīng)劑量的pOPRL+pOPRF疫苗，空載體pcDNA3.1(+)組和PBS組的每只小鼠則分別予以肌肉注射100 μL的pcDNA3.1(+)和pH 7.2的1×PBS。各組小鼠均進(jìn)行3次免疫，每次間隔2周。

1.5血清特異性抗體的測定 從第1次免疫后1周時開始對各免疫組的小鼠進(jìn)行斷尾采血，離心分離血清后以間接ELISA法測定血清特異性抗體水平，總共檢測6周。以提取的銅綠假單胞菌的外膜蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，包被濃度為20 μg/mL。隨后以5%的BSA封閉2 h，再加入1∶100稀釋的待測血清，37 ℃反應(yīng)1.5 h。再經(jīng)PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，反應(yīng)1.5 h后加入OPD在暗室中顯色10 min，以2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD492nm的值。

1.6免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分析 每次免疫2周后按文獻(xiàn)方法制備免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞懸液，MTT法測定其增殖水平[11]。每組取5只小鼠，脫頸處死后無菌分離制備脾淋巴細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/mL。取50 μL脾淋巴細(xì)胞懸液加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并設(shè)陰性對照。隨后向試驗孔中加入20 μg/mL的銅綠假單胞菌的外膜蛋白50 μL，陰性對照孔則加入50 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液。將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱中反應(yīng)72 h后取出，然后向每個反應(yīng)孔中加入10 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)放置于在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后離心棄掉上清液，然后向每孔中加入150 μL的 DMSO，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置10 min后測定OD570 吸光值，按下述公式計算刺激值(SI)=OD(試驗孔)/OD(陰性對照孔)。

1.7細(xì)胞因子分泌水平測定 每次免疫后2周時按照上述方法制備各免疫組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞懸液，用銅綠假單胞菌外膜蛋白刺激后在5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，離心后取培養(yǎng)上清液，以小鼠IFN-γ和IL-2檢測試劑盒測定2種細(xì)胞因子的濃度。

1.8攻毒實驗 3免2周后以銅綠假單胞菌強(qiáng)毒菌株對各免疫組剩余的20只小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察15 d，每天記錄小鼠死亡情況，實驗結(jié)束后根據(jù)各組的死亡情況繪制小鼠的存活曲線，并計算各免疫組的保護(hù)率。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SAS 9.4統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各免疫組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒pOPRL和pOPRF的鑒定 PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因，連接真核載體pcDNA3.1(+)后以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，如圖1所示，經(jīng)酶切后獲得大小約為517 bp和1 063 bp的DNA片段，表明重組質(zhì)粒pOPRL和pOPRF構(gòu)建成功。

M為 DNA Marker DL2000， A-1和B-1分別為pOPRL和pOPRF雙酶切鑒定結(jié)果圖1 重組質(zhì)粒pOPRL和pOPRF雙酶切鑒定Fig.1 Electrophoresis of the two enzymes digestion of pOPRL and pOPRF

2.2免疫小鼠血清抗體水平 間接ELISA測定各免疫組小鼠血清抗體水平，結(jié)果如圖2所示。隨著免疫次數(shù)的增加，各劑量組免疫小鼠的血清特異性抗體水平均逐漸上升，且高于兩對照組(F=15.326，P<0.01)。2免和3免后，100 μg和200 μg免疫組的血清抗體水平高于25 μg和50 μg免疫組(F=8.139，P<0.05)，但100 μg和200 μg免疫組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=1.662，P>0.05)。

圖2 各免疫組小鼠血清抗體水平檢測結(jié)果Fig.2 Dynamic changes of serum antibody levels in vaccinated mice

2.3脾淋巴細(xì)胞增殖檢測結(jié)果 每次免疫2周時制備免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，以銅綠假單胞菌外膜蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)后，MTT法測定其增殖情況。如圖3，免疫后各劑量二價組合DNA疫苗組的SI值始終高于pcDNA3.1(+)組和PBS組(F=13.477，P<0.01)。初次免疫后各劑量組的SI之間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.862，P>0.05)，2免和3免后100 μg和200 μg免疫組的SI值則與25 μg和50 μg免疫組之間呈現(xiàn)出明顯的差異(F=7.419，P<0.05)。雖然2免和3免后100 μg組的SI值稍高于200 μg組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.107，P>0.05)。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平Fig.3 Splenic lymphocytes proliferation in vaccinated mice

2.4細(xì)胞因子檢測結(jié)果 每次免疫2周時制備銅綠假單胞菌外膜蛋白刺激的脾淋巴細(xì)胞懸液，測定其分泌的IFN-γ和IL-2的濃度。如圖4所示，每次免疫后各免疫劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-2的濃度始終高于兩組對照組(F=17.355，P<0.01)。第一次免疫后，各劑量組分泌的IFN-γ和IL-2的量無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.751，P>0.05)，而2免和3免后100 μg和200 μg免疫組兩種細(xì)胞因子的濃度明顯高于25 μg和50 μg免疫組(F=9.684，P<0.05)，且在3免后100 μg組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-2高于200 μg免疫組(F=6.375，P<0.05)。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ(A)和IL-2(B)濃度Fig.4 Concentrations of IFN-γ (A) and IL-2 (B) from spleen lymphocytes of vaccinated mice

2.5動物攻毒試驗結(jié)果 第3次免疫后以銅綠假單胞菌強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒，記錄各組小鼠的死亡時間。如圖5所示，攻毒后pcDNA3.1(+)組和PBS組的小鼠迅速死亡，存活時間均未超過5 d。25 μg和50 μg免疫組的小鼠在攻毒后第2 d開始出現(xiàn)死亡，至第15 d時其存活數(shù)分別為7只和9只。100 μg和200 μg免疫組的小鼠在攻毒后第3 d出現(xiàn)死亡，分別于攻毒后第5 d和第6 d開始死亡數(shù)量不再增加，保持為17只和14只。因此，25 μg、50 μg、100 μg和200 μg的銅綠假單胞菌二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF為小鼠提供的保護(hù)率分別為35%、45%、85%和70%。

圖5 攻毒后各組小鼠存活情況Fig.5 Survival curve of vaccinated mice after challenge

3 討 論

銅綠假單胞菌是一種可導(dǎo)致人類和多種動物疾病的常見人獸共患病原菌，由于其耐藥性的日益嚴(yán)重和可用商品化疫苗的缺乏給該病原菌引起的相關(guān)疾病的臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)，因此需加大對該病原菌有效疫苗的研究開發(fā)。目前國內(nèi)外對于其相關(guān)疫苗的研究不在少數(shù)，包括滅活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程亞單位疫苗、DNA疫苗、結(jié)合疫苗等在內(nèi)的都有相關(guān)研究報道[12-16]。本課題組前期以銅綠假單胞菌的oprL和oprF基因構(gòu)建了多種DNA疫苗，動物實驗結(jié)果顯示二價組合DNA疫苗pOPRL+pOPRF具有較好的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步提高其免疫效果，本實驗對其最佳免疫劑量進(jìn)行了探索。

抗體應(yīng)答在抗感染免疫中發(fā)揮著重要的作用，本實驗檢測了各劑量的pOPRL+pOPRF誘導(dǎo)的血清抗體水平，結(jié)果表明高劑量的二價組合DNA疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力優(yōu)于低劑量。除抗體應(yīng)答外，本實驗也對各劑量DNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平進(jìn)行了檢測，淋巴細(xì)胞增殖試驗和細(xì)胞因子分泌試驗是衡量細(xì)胞免疫水平較為常用方法[17]。本實驗以銅綠假單胞菌外膜蛋白為特異性刺激物用以誘導(dǎo)各免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞，與抗體檢測結(jié)果相似，高劑量組免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力優(yōu)于低劑量組。本實驗的前期研究顯示二價組合DNA疫苗可誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答，而其誘導(dǎo)的Th2型免疫應(yīng)答并不優(yōu)于單價DNA疫苗和二基因融合DNA疫苗[9]。因此，本實驗僅對不同劑量的pOPRL+pOPRF誘導(dǎo)的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2進(jìn)行了測定，結(jié)果表明當(dāng)免疫劑量為100 μg時其誘導(dǎo)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ和IL-2濃度高于其他各劑量組。攻毒實驗結(jié)果亦顯示100 μg的pOPRL+pOPRF可為小鼠提供高于其他劑量的保護(hù)效果。因此，本實驗研究結(jié)果表明銅綠假單胞菌二價組合DNA疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫效果及為小鼠提供的保護(hù)效果與免疫劑量有一定的相關(guān)性，但并非越高越好，對小鼠而言最佳免疫劑量為100 μg/只。

利益沖突：無