石云鋒,師小函,巴俊慧,陳健寧,羅進梅,吳本權

甲型流感病毒(甲流病毒)引起急性呼吸道感染，可導致大范圍傳播流行。H1N1、H5N1、H7N9等亞型具有從哺乳動物或禽類傳染至人類的能力，給人類健康及全球公共衛(wèi)生帶來極大的威脅和挑戰(zhàn)[1-2]。甲流病毒感染易合并或繼發(fā)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染，引起重癥肺炎，病死率高達60%[3]。在肺炎早期，肺泡巨噬細胞介導的非特異性免疫占抗感染免疫的主要作用。NLRP3炎癥小體是肺泡巨噬細胞發(fā)揮抗感染免疫作用的重要模式識別受體，誘導白介素(interleukin，IL)-1β的釋放，介導下游的炎癥反應。大量研究表明，NLRP3炎癥小體在抗甲流病毒免疫中發(fā)揮保護作用[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，MRSA經(jīng)吞噬溶酶體途徑亦可激活NLRP3炎癥小體[5]。但NLRP3炎癥小體在甲流病毒與MRSA肺炎早期的具體作用及強度如何，目前國內(nèi)外未見對比研究。本文以甲流病毒鼠肺適應株H1N1/FM1與 MRSA臨床分離株分別感染小鼠建立肺炎模型，對比分析NLRP3炎癥小體在肺炎早期的活性及相應的炎癥反應，探討NLRP3炎癥小體在甲流病毒肺炎與MRSA肺炎早期的作用差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1甲型流感病毒H1N1/FM1株、MRSA菌株及實驗小鼠 甲型流感病毒H1N1/FM1(甲流病毒H1N1)為鼠肺適應株，獲贈于暨南大學醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室。MRSA菌株為中山大學附屬第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科實驗室分離鑒定的臨床菌株。雄性健康C57BL/6小鼠15只，鼠齡30～35 d，購于廣東省實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002，SPF條件下飼養(yǎng)，隨機分成空白對照組、甲流病毒H1N1組、MRSA組3組，每組5 只。本研究嚴格遵循《赫爾辛基宣言》相關原則。

1.1.2主要試劑 MLV第一鏈合成試劑盒、SYBR○Rselect master mix購于美國Life Technologies公司；NLRP3單克隆兔抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；NLRP3免疫熒光羊抗兔二抗購于美國R&D公司；內(nèi)參抗體GAPDH兔抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、凱基全蛋白提取試劑盒及凱基BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購于廣州杰特偉科技有限公司；ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方 法

1.2.1甲流病毒H1N1復蘇、毒力測定 復蘇液氮罐中凍存的甲流病毒H1N1/FM1株，于9 d齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次擴增，以雞紅細胞血凝試驗測定擴增的病毒效價。用無血清DMEM培養(yǎng)液對H1N1/FM1病毒株行連續(xù)10倍遞次稀釋至10-8。參考實驗基礎確定半數(shù)致死量(LD50)濃度[6-7]。

1.2.2細菌培養(yǎng) 在室溫下解凍-80 ℃凍存的MRSA菌株，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱過夜培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取菌落溶于無菌PBS中，測定其在600 nm處吸光度(optical density，OD600)。OD600=0.6時細菌含量約1×109/mL。預實驗確定半數(shù)致死量為OD600=0.6之菌液50 μL。

1.2.3甲流病毒H1N1及MRSA滴鼻建立小鼠肺炎模型 腹腔注射10%水合氯醛80 μL麻醉小鼠。空白對照組每只小鼠以50 μL PBS液滴鼻，甲流病毒H1N1組每只小鼠以50 μL LD50濃度的甲流病毒H1N1滴鼻，MRSA組每只小鼠以50 μL測定OD600為0.6的MRSA菌液滴鼻，感染24 h，觀察記錄小鼠的一般生存狀況、死亡率、體重等。體重變化率(%)=(24 h體重-初始體重)/初始體重×100%。

1.2.4標本取材 感染24 h后，眼眶取血后處死小鼠，血清留作IL-1β細胞因子檢測，摘取小鼠肺臟，左肺上葉和下葉分別留作提取蛋白和RNA，右肺留作病理切片和HE染色。

1.2.5RT-qPCR法檢測NLRP3蛋白和IL-1β的mRNA表達水平 將各組小鼠肺組織稱重，研磨制成懸液，用Trizol法提取組織總RNA，檢測RNA的濃度。采用ABI7500系統(tǒng)進行PCR反應，反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火，共進行40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s延伸。記錄目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，用mRNA=2-ΔΔCT計算 mRNA相對表達量。PCR反應引物見表1。

1.2.6Western Blot法檢測NLRP3蛋白的表達水平 分別裂解每只小鼠肺組織后，提取總蛋白。按凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書，測定蛋白濃度。按Western Blot步驟，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，在Chemi Scope化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，用Image J軟件分析目的蛋白灰度值，計算其蛋白相對表達量。

1.2.7ELISA檢測血清中IL-1β的濃度 根據(jù)ELISA檢測試劑盒的操作流程，空白孔及每個標準品設3個復孔，制作標準曲線，檢測小鼠血清IL-1β的濃度。

2 結 果

2.1小鼠生存狀況 各組小鼠均全部存活。空白對照組進食、活動如常，24 h后平均體重增加4.32%；甲流病毒H1N1組及MRSA組均出現(xiàn)豎毛、攝食量下降、活動減少的情況，24 h后兩組平均體重分別減輕5.88%與6.07%。

2.2小鼠肺組織病理切片結果 空白對照組小鼠肺組織病理切片未見病理損傷，支氣管壁完整，肺泡內(nèi)無炎癥細胞浸潤。甲流病毒H1N1組小鼠肺組織見局灶性支氣管炎和彌散性間質(zhì)肺炎，較多的炎癥細胞浸潤，血管擴張充血，肺泡結構破壞。MRSA組小鼠肺組織病理可見炎癥反應如甲流病毒H1N1組，但充血情況明顯加重，表現(xiàn)出更嚴重的炎癥反應(圖1)。

A：control group； B： H1N1 group； C：MRSA group； A1、B1、C1 HE ×100；A2、B2、C2 HE×400圖1 甲流病毒H1N1和MRSA感染24 h致小鼠肺炎組織病理改變 HE染色Fig.1 Pathology of pneumoniae caused by influenza H1N1 and MRSA infection for 24 h in mouse.

2.3甲流病毒H1N1組與MRSA組NLRP3蛋白的mRNA及蛋白相對表達量 甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺組織NLRP3蛋白的mRNA表達明顯升高，與空白對照組、MRSA組比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=38.782，P均<0.05，圖2A)。MRSA組NLRP3蛋白的mRNA表達水平也升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=38.372，P=0.03，圖2A)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺組織NLRP3蛋白的表達明顯升高，與空白對照組、MRSA感染組比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=1 325.64，P均<0.01，圖2B和2C)，與mRNA表達水平的結果相一致。MRSA組NLRP3蛋白表達水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1 325.64，P=0.08，圖2B和2C)。

A:representative of the NLRP3 mRNA level in mice subjected to different treatments；B:representative of the NLRP3 protein level in mice subjected to different treatments；C:representative of the quantification of the protein level of NLRP3 subjected to different treatments；1) P<0.05；2) P<0.01圖2 甲流病毒H1N1和MRSA感染小鼠24 h肺組織NLRP3蛋白的mRNA及蛋白表達水平Fig.2 mRNA and protein level of NLRP3 in influenza H1N1 and MRSA infected mouse for 24 h

2.4甲流病毒H1N1組與MRSA組IL-1β的mRNA相對表達及血清濃度 甲流病毒H1N1感染引起小鼠肺組織IL-1β的mRNA表達升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=1 253.97，P<0.01，圖3A)。甲流病毒H1N1感染引起小鼠血清IL-1β濃度升高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=41.97，P<0.01，圖3B)。MRSA組IL-1β的mRNA表達水平明顯升高，與空白對照組、甲流病毒H1N1組比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=1 253.97，P均<0.01，圖3A)。MRSA組血清IL-1β濃度明顯升高，高于甲流病毒H1N1組與空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(F=41.97，P均<0.01，圖3B)。

A:mRNA level of IL-1β in in mice subjected to different treatments；B:serum concentrations of IL-1β in mice subjected to different treatments；2) P<0.01圖3 甲流病毒H1N1和MRSA感染小鼠24 h肺組織IL-1β的mRNA相對表達量和小鼠血清中IL-1β的濃度Fig.3 mRNA level and serum concentrations of IL-1β in influenza H1N1 and MRSA infected mice for 24 h

3 討 論

甲流病毒感染的靶細胞為呼吸道上皮細胞，其能直接感染肺泡巨噬細胞及樹突狀細胞等免疫細胞，引起炎癥反應及肺損傷[8]。甲流病毒感染的預后取決于機體的免疫反應及有無繼發(fā)感染。甲流病毒感染繼發(fā)細菌性肺炎，是導致臨床死亡的主要原因，而MRSA是繼發(fā)感染最常見的細菌[9]。甲流病毒與MRSA在致病及免疫應答方面存在某些相關。

在甲流病毒及MRSA肺炎的早期，機體抗感染的主要機制是固有免疫反應。其中最重要的免疫細胞是肺泡巨噬細胞[10]，數(shù)量占肺泡灌洗液中細胞成分的80%。而位于其細胞質(zhì)中的NOD樣受體(NOD like receptor，NLRs)是其在感染早期介導固有免疫反應的機制之一[11]。

NLR途徑在抗感染中的作用以NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體研究最為深入。NLRP3炎癥小體的活性形式是由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)與半胱天冬酶1(caspase-1)形成的三聚體。其中NLRP3蛋白是NLRP3炎癥小體活性的核心。NLRP3炎癥小體的激活及信號傳遞存在雙信號通道。信號通路1為模式識別受體如Toll樣受體(TLRs)識別各種病原微生物及其組成成分，通過NF-κB途徑，誘導IL-1β基因的表達，分泌無活性的pro-IL-1β。信號通路2為NLRP3炎癥小體三聚體形成，自剪切無活性的caspase-1為活化的cleaved-caspase-1，cleaved-caspase-1剪切pro-IL-1β為IL-1β。IL-1β進一步誘導炎癥細胞因子、氧化因子和趨化因子的釋放，觸發(fā)炎癥反應清除病原體并自我調(diào)節(jié)炎癥反應強度[12]。因此，絕大多數(shù)研究選用NLRP3蛋白及IL-1β監(jiān)測NLRP3炎癥小體活性及炎癥反應強度。

大量研究認為，甲流病毒激活NLRP3炎癥小體并介導炎癥反應，在甲流病毒感染中的被激活對機體起保護作用[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比，甲流病毒H1N1組NLRP3蛋白的mRNA表達及蛋白表達均增強，IL-1β的mRNA表達及血清濃度也升高，肺組織病理發(fā)現(xiàn)炎癥反應，表現(xiàn)出NLRP3炎癥小體信號鏈的活化?？梢酝普揘LRP3炎癥小體在甲流病毒性肺炎的早期活化并起促進炎癥反應作用，感染早期適度的炎癥反應有助于清除病原體，與主流的研究相一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)，MRSA組比空白對照組NLRP3蛋白的mRNA表達稍增高，Western blot檢測NLRP3蛋白表達與空白組比較差異沒有統(tǒng)計學意義，但NLRP3蛋白的mRNA及Western blot均低于甲流病毒H1N1組。然而，MRSA組IL-1β的mRNA表達明顯增加，血清IL-1β濃度也明顯升高，明顯高于空白對照組，也高于甲流病毒H1N1組，表明MRSA肺炎早期炎癥反應比甲流病毒H1N1肺炎更為嚴重，肺組織病理進一步證實了該發(fā)現(xiàn)。該發(fā)現(xiàn)也解釋了甲流病毒與MRSA在感染早期致病力不同的現(xiàn)象。

MRSA組IL-1βmRNA水平及蛋白表達水平的增強與NLRP3蛋白的活化程度不相一致，表明NLRP3炎癥小體不在MRSA肺炎早期IL-1β的產(chǎn)生及炎癥反應中起主要作用。分析可能的機制如下：①雖然也有研究發(fā)現(xiàn)MRSA可通過吞噬-溶酶體途徑產(chǎn)生的活性氧激活NLRP3炎癥小體[5]，但這個過程是間接的，NLRP3炎癥小體的激活依賴MRSA結構成分肽聚糖在吞噬體內(nèi)的降解過程。MRSA通過其它途徑可更直接更快速地刺激炎癥細胞釋放炎癥細胞因子，如本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)MRSA可通過TLR2-NF-κB途徑引起巨噬細胞壞死及大量TNF-α、IL-10釋放[14]。②甲流病毒H1N1激活NLRP3炎癥小體引起炎癥細胞焦亡，反饋調(diào)節(jié)炎癥反應強度。有研究顯示，多種甲流病毒株與肺泡巨噬細胞共培養(yǎng)激活NLRP3炎癥小體，在8～24 h肺泡巨噬細胞產(chǎn)生IL-10增加，反饋抑制了強烈的炎癥反應[12]。③其它的炎癥細胞如中性粒細胞參與了抗甲流病毒及抗MRSA的早期免疫反應。研究發(fā)現(xiàn)，甲流病毒感染引起肺炎時，中性粒細胞為NLRP3炎癥小體提供過氧化物等活化的第二信號促進肺泡巨噬細胞釋放IL-1β[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在MRSA感染中，中性粒細胞不經(jīng)NLRP3炎癥小體途徑而由RIPK3通路促進肺泡巨噬細胞釋放IL-1β[16]。結合上述討論及本研究結果提示，在MRSA肺炎的防治中，應積極尋找別的靶點或信號途徑，如其它的炎癥小體甚至別的模式識別受體，尤其是甲流病毒感染繼發(fā)MRSA肺炎時，不能單一關注NLRP3炎癥小體通路。

綜上，本研究驗證了NLRP3炎癥小體在甲流病毒性肺炎早期的活性及作用，并推測NLRP3炎癥小體并不在MRSA肺炎早期更劇烈的炎癥反應中起主要作用，后者的炎癥反應有其它的信號通路或炎癥細胞參與介導。但是，需要多個時間點的實驗設計才能系統(tǒng)地驗證NLRP3炎癥小體在MRSA感染中的作用。同時，NLRP3炎癥小體還包含ASC、caspase-1等結構成份，NLRP3炎癥小體在甲流病毒與MRSA單獨感染甚至混合感染時的具體作用、機制以及信號網(wǎng)絡有待后續(xù)進一步深入研究。

利益沖突：無