韋宗勇，肖展宏，黎裕明

南寧市第一人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科1、骨科2，廣西 南寧 530001

骨骼為支撐人體運(yùn)動的主要結(jié)構(gòu)，在日常生活中易因創(chuàng)傷而骨折，骨缺損、骨折愈合不良是臨床一大難題。組織工程成骨分化為臨床骨組織需求帶來了希望之光，種子細(xì)胞如人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)是組織工程成骨分化的核心和重點(diǎn)[1]。hADSCs 身體儲量豐富、來源廣泛、容易獲得、低免疫原性、培養(yǎng)便捷、性能穩(wěn)定、分化潛能好[2]。然而目前hADSCs 定向成骨分化能力仍未達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)，因而制約了其臨床應(yīng)用。諸多研究顯示miRNAs參與了人體多種生理、病理過程，包括調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[3]。miR-217 在多種細(xì)胞系中發(fā)揮了不同的生理功能，本課題主要檢測miR-217 在調(diào)控hADSCs 成骨分化中發(fā)揮的作用機(jī)制，以期能為優(yōu)化hADSCs 定向成骨分化的組織工程化骨提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自Gibco；Dexamethasone、β-glycerophosphate、Vitamin-C購自Sigma公司；Trizol試劑盒(Invitrogen)、PCR試劑盒(Applied Biosystems)，Lipo 3000 (Invitrogen)，miR-217 mimic、miR-217 inhibitor和對照購自上海吉凱。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分離培養(yǎng) 依據(jù)既往研究報(bào)道[4]，經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)，和經(jīng)得本人簽署知情同意書，獲取人體脂肪組織并分離hADSCs，培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)基中，取第三代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 hADSCs 成骨誘導(dǎo) 將不同分組的hADSCs 接種于6 孔板、每組3 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)部貼壁后進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化，進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成成分包括10%FBS、0.1 μmol/L Dexamethasone、10 mmol/L β-glycerophosphate和50 mg/L Vitamin-C。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 依據(jù)說明書進(jìn)行操作，將miR-217 模擬物和miR-control、miR-217 抑制劑和對照物轉(zhuǎn)染至hADSCs，24 h 后更換培養(yǎng)基。hADSCs細(xì)胞生長融合度達(dá)到約70%時(shí)采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.2.4 qPCR 反應(yīng) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。其反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。隨后以GAPDH 為內(nèi)參、采用2-ΔΔCt法計(jì)算各個(gè)基因相對表達(dá)量。miRNA 擴(kuò)增以BioTNT 的miRNA 定量PCR試劑盒操作，U6 作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 茜素紅染色 成骨分化誘導(dǎo)14 d，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水洗3 次，配制pH 8.3 的0.1%ARS-Tris-Hcl 染料，37℃反應(yīng)1 h，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，所有計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs生長曲線 倒置相差顯微鏡下顯示第三代hADSCs 呈梭形、束狀或者紡錘形的細(xì)胞狀排列，細(xì)胞核位于中央、細(xì)胞輪廓清晰、體外附著于細(xì)胞培養(yǎng)瓶上的一定底物而生長(圖1)。CCK8 檢測顯示hADSCs 細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)S 形，3～6 d 為細(xì)胞對數(shù)生長期，6 d達(dá)高峰后隨后逐漸降低進(jìn)入平臺期。

2.2 miR-217在hADSCs 成骨分化中高表達(dá) 為了檢測hADSCs成骨分化過程中參與的microRNA，分別于0 d及21 d收集誘導(dǎo)分化的細(xì)胞、提取總RNA，基因芯片顯示此過程中多個(gè)microRNA 表達(dá)上調(diào)，其中miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 升高趨勢最明顯。隨后提取0 d、7 d、14 d及21 d誘導(dǎo)分化細(xì)胞的總RNA，采用qRT-PCR 檢測顯示隨著hADSCs 成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長，miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 表達(dá)都逐漸升高、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)與誘導(dǎo)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中miR-217升高最顯著，因此本研究選擇miR-217作為后續(xù)研究，見圖2。

圖1 第3代hADSCs形態(tài)及生長曲線

2.3 miR-217調(diào)控hADSCs增殖 應(yīng)用12.5 nmol/L、25 nmol/L 及50 nmol/L 濃度的上述質(zhì)粒[miR-217 模擬物(miR-217 mimics)和miR-control、miR-217 抑制劑(miR-217 inhibitors)和anti-miR-control]轉(zhuǎn)染hADSCs，qRT-PCR 結(jié)果顯示miR-217 mimics 和inhibitors分別顯著促進(jìn)或抑制miR-217表達(dá)，效果體現(xiàn)出濃度劑量依賴性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。后續(xù)試驗(yàn)采用50 nmol/L 濃度的miR-217 模擬物或抑制劑。

圖2 microRNA在hADSCs成骨分化過程中表達(dá)情況

為了驗(yàn)證miR-217 對hADSCs 增殖的調(diào)控，hADSCs 分 為 四 組(miR-217 mimics 和miR-control、miR-217 inhibitors 和anti-miR-control)，處理0 d、1 d、2 d、3 d 和4 d后中斷反應(yīng)，CCK8 檢測發(fā)現(xiàn)miR-217 mimics 促 進(jìn)hADSCs 增 殖，miR-217 inhibitors 抑 制hADSCs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

2.4 miR-217 促進(jìn)hADSCs 成骨分化 為探討miR-217 調(diào)節(jié)hADSCs 成骨分化的效果，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按照上述分組，誘導(dǎo)7 d 后提取總RNA。RT-PCR 結(jié)果顯示，miR-217 mimics 能促進(jìn)hADSCs 內(nèi)成骨相關(guān)基因ALP (堿性磷酸酶)、OCN (骨鈣蛋白)、Runx2(Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2)、Osterix (成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子)mRNA 的表達(dá)，miR-217 inhibitors 則抑制上述基因表達(dá)，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖3 RT-PCR檢測各濃度轉(zhuǎn)染組miR-217的相對表達(dá)量

圖4 CCK8 檢測發(fā)現(xiàn)miR-217 mimics 促進(jìn)hADSCs 增殖，miR-217 inhibitors能夠抑制hADSCs增殖

茜素紅染色顯示miR-217 mimics 處理并成骨誘導(dǎo)7 d 后的hADSCs細(xì)胞茜素紅染色陽性明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染miR-217 inhibitors 后細(xì)胞茜素紅染色陽性顯著減弱，提示過表達(dá)miR-217 可增強(qiáng)hADSCs 的成骨鈣沉積活性，見圖6。

圖5 miR-217 mimics和miR-217 inhibitors對成骨相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控注：RT-PCR顯示miR-217 mimics能促進(jìn)ALP(A)、OCN(B)、Runx2(C)、Osterix(D)mRNA表達(dá)，miR-217 inhibitors抑制上述基因表達(dá)；aP＜0.05。

圖6 miR-217 調(diào)控hADSCs成骨分化的茜素紅染色結(jié)果(×20)

3 討論

骨骼為支撐人體運(yùn)動的主要結(jié)構(gòu)，日常生活中易因創(chuàng)傷而骨折，骨缺損、骨折愈合不良是臨床一大難題。組織工程成骨為臨床骨組織需求帶來希望，種子細(xì)胞是組織工程的重點(diǎn)，hADSCs身體儲量豐富、來源廣泛、獲取容易、免疫原性低、培養(yǎng)便捷、性能穩(wěn)定、分化潛能好，因而是首選種子細(xì)胞。然而目前hADSCs定向成骨分化能力仍未達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)，因而制約了其臨床應(yīng)用，外源性干預(yù)有助于提高h(yuǎn)ADSCs 成骨分化效率，因而值得進(jìn)一步研究。

microRNA(miRNA，微小RNA)是近年來逐漸引起廣泛關(guān)注和重視的、在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類5'端帶磷酸基團(tuán)、3'端帶22 nt左右長度羥基的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA。成熟的miRNAs 是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶剪切加工而產(chǎn)生，隨后組裝進(jìn)RNA成為誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA 或者阻遏靶mRNA 的翻譯。miRNA的主要功能為調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控及個(gè)體發(fā)育進(jìn)程。研究顯示miRNAs參與了多種細(xì)胞生物行為學(xué)功能、發(fā)揮了極其重要的作用，如miRNAs調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、凋亡和向成骨細(xì)胞分化[5]。既往研究顯示miR-384-5p通過調(diào)控下游靶基因Gli2、從而達(dá)到抑制BMSCs 細(xì)胞的成骨分化[6]；SIRT1 通過miR-132-3p 調(diào)控MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化，SIRT1 過表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞MC3T3-E1 增殖和成骨分化[7]；miR-124 可以通過靶基因Sp7 來調(diào)節(jié)BMSCs 細(xì)胞的成骨分化，miR 124 mimics 能夠顯著上調(diào)BMSCs 細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因ALP和osteocalcin表達(dá)[8]；CHEN等[9]通過活體和離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-375 促進(jìn)hADSCs成骨分化，并且證實(shí)miR-375是通過靶基因YAP1和YAP1/DEPTOR/AKT 網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控hADSCs 成骨分化。miR-217的相關(guān)研究已經(jīng)有諸多報(bào)道，miR-217通過靶基因SIRT1抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[10]；miR-217 通過抑制靶基因TLR5 表達(dá)從而緩解神經(jīng)病理學(xué)疼痛[11]；miR-217 通過抑制靶基因DKK1 促進(jìn)BMSCs 細(xì)胞增殖和成骨分化[12]。miRNA 對hADSCs成骨分化的研究也有相關(guān)報(bào)道，然而現(xiàn)在尚無關(guān)鍵性進(jìn)展，亦無臨床應(yīng)用。

本研究通過分離并離體培養(yǎng)hADSCs、誘導(dǎo)其成骨分化，采用CCK8 及qRT-PCR 等方法檢測miR-217對hADSCs 成骨分化的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著hADSCs 成骨分化進(jìn)程的進(jìn)展，miR-217 表達(dá)呈上升趨勢，推測miR-217 可以正向調(diào)控hADSCs 成骨分化。隨后采用miR-217 mimics 和miR-217 inhibitors分別過表達(dá)和抑制hADSCs 細(xì)胞中miR-217 的表達(dá)，同時(shí)檢測hADSCs 成骨分化的進(jìn)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-217 模擬物能促進(jìn)hADSCs 內(nèi)成骨相關(guān)基因Osterix、OCN、Runx2、ALP mRNA 的表達(dá)，miR-217 抑制劑則可以抑制上述成骨相關(guān)基因表。同時(shí)為直觀觀察hADSCs 成骨分化的礦化結(jié)節(jié)，我們采用茜素紅染色檢測hADSCs 是否已經(jīng)成功向成骨細(xì)胞分化，結(jié)果顯示miR-217 mimics 轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)了hADSCs 細(xì)胞茜素紅染色陽性；提示miR-217 對hADSCs 成骨分化起著正向調(diào)控作用。

綜上所述，本研究系統(tǒng)性地研究miR-217對hADSCs 細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化的影響作用，我們發(fā)現(xiàn)miR-217 可以正向促進(jìn)hADSCs 內(nèi)成骨相關(guān)基因Osterix、OCN、Runx2、ALP 的表達(dá)，提示過表達(dá)miR-217可以正向促進(jìn)hADSCs成骨分化的進(jìn)程。