吳彩霞，劉朝明*，顏泉梅，張全軍，歐陽振，趙 宇，樊娜娜，賴良學(xué)，2*

(1.中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

通過靶向修飾關(guān)鍵調(diào)控基因制備的動(dòng)物模型，能夠模擬人類疾病發(fā)生，對于研究疾病的發(fā)病機(jī)理與評價(jià)治療策略的安全性和有效性均具有重要意義[1]。在生物醫(yī)藥研究中，嚙齒類動(dòng)物模型往往不能精確有效地模擬某些疾病的發(fā)展進(jìn)程。豬與人類的親緣關(guān)系更近，在很多方面與人類高度相似，主要表現(xiàn)在解剖結(jié)構(gòu)、器官發(fā)育、疾病的發(fā)展進(jìn)程等[2]。近年來豬的體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，豬作為一種供食用的動(dòng)物，在開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)受到的倫理限制少等優(yōu)勢，為科學(xué)家利用轉(zhuǎn)基因豬來研究人類疾病發(fā)病機(jī)制、評估新的治療方案提供了倫理支持[3]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)可以改善代謝綜合癥相關(guān)的代謝異常[4]。PPARγ是胰島素敏感的噻唑類藥物(thiazolidinediones，TZDs)的靶標(biāo)，噻唑烷二酮類藥物(例如文迪雅)是胰島素增敏劑，2006年曾經(jīng)是臨床上銷售額最大的治療糖尿病的藥物[5]。PPARγ是調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)代謝的重要因子，在血管、心臟組織均有表達(dá)[6]。TZDs在 20世紀(jì)80年代被作為一種抗氧化劑應(yīng)用，可降低糖尿病患者血糖水平而不增加血漿胰島素濃度。由于小鼠和人類心血管系統(tǒng)的差異，在小鼠模型中TZDs激活 PPARγ對心血管疾病具有很好的治療效果，然而在人的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)TZDs會引起肝臟損害、體質(zhì)量增加等不良反應(yīng)，導(dǎo)致TZDs使用受到限制[7]。有意思的是，心肌特異性敲除PPARγ的小鼠表現(xiàn)出隨年齡增長逐漸進(jìn)展的心肌肥大，而在小鼠中羅格列酮治療會引起心肌肥大[8]。而羅格列酮治療心肌特異性敲除PPARγ的小鼠也同樣會引起心肌肥大，只不過程度較輕而已。說明在心肌細(xì)胞中，羅格列酮可以不依賴于PPARγ而誘發(fā)心肌肥大,但是之前用吡格列酮進(jìn)行的研究并沒有心肌肥大的報(bào)道。因此，導(dǎo)致心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加的TZD類藥物特定的靶向PPARγ及其脫靶的功能仍是一個(gè)有爭議的和有待進(jìn)一步研究的領(lǐng)域。但由于在小鼠模型中得出的結(jié)論并不適用于人類，急需一種新的能夠模擬人類的大動(dòng)物模型用于研究PPARγ在心血管系統(tǒng)中的功能及其與糖尿病的關(guān)系,豬的心血管系統(tǒng)與人類比較接近是人類心血管疾病最理想的動(dòng)物模型[9]。本研究將采用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，在國際上率先建立PPARγ基因修飾豬模型，為研究PPARγ基因功能提供更好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料分子試驗(yàn)相關(guān)試劑無特殊說明均購自TaKaRa 公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑無特殊說明均為 Gibco；化學(xué)試劑無特殊說明均購自Sigma 公司。試驗(yàn)豬均來自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院醫(yī)用豬大動(dòng)物基地；所用細(xì)胞均由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)實(shí)驗(yàn)室自己分離凍存；所用卵均由我們從廣州市屠宰場取回后由本實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)成熟。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)管理和使用都符合公共衛(wèi)生服務(wù)條例，動(dòng)物福利法規(guī)以及中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院關(guān)于保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)政策(國際AAALAC標(biāo)準(zhǔn))；所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用操作規(guī)程進(jìn)行操作；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用均得到中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和管理委員會的許可，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：#A5748-01。

1.2 豬胎兒成纖維細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)染及篩選鑒定

1.2.1豬胎兒成纖維細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)染 取約1×107個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，加入TALENs質(zhì)粒與pcDNA 3.1質(zhì)粒各50 μg，經(jīng)電轉(zhuǎn)儀共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞篩選 電轉(zhuǎn)后細(xì)胞分裝到15個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中，隔天換為含G418的細(xì)胞培養(yǎng)基，篩選8～10 d后，挑取細(xì)胞克隆。

1.2.3挑取克隆 在克隆環(huán)中加胰酶覆蓋底部，消化5 min后加培養(yǎng)基終止反應(yīng)。將每個(gè)克隆環(huán)中的細(xì)胞移入48孔板的1個(gè)孔中培養(yǎng)，第2天換液。

1.2.4 克隆的傳代待培養(yǎng)于48孔板中的細(xì)胞克隆長滿后需傳代并取細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.5克隆的鑒定 加入10 μL NP40裂解液，置于烘箱中裂解，取出置于-20℃冰箱冷卻。以細(xì)胞裂解液為模板，進(jìn)行PCR鑒定。

1.3 基因修飾克隆豬的制作

1.3.1成熟液準(zhǔn)備 24孔板，每孔0.5 mL成熟液，以石蠟油覆蓋后置于CO2培養(yǎng)箱中平衡3 h以上。

1.3.2卵子準(zhǔn)備 在配有熱臺的體式鏡下用手吸管撿取卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，體外成熟培養(yǎng)42～44 h 后，之后轉(zhuǎn)移入39℃去卵丘操作液，將消化后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移入盛有操作液的皿中，體式鏡下挑取排放第1極體的卵母細(xì)胞于另一盛有操作液的皿中保存，待用。

1.3.3制作核移植操作滴： 在皿蓋中滴上50μL去核操作滴，排成中間1點(diǎn)、外圈包圍5點(diǎn)的形狀，另外在外圈滴上2小滴10%PVP，在皿中輕柔加入石蠟油，直至覆蓋所有液滴。

1.3.4卵母細(xì)胞去核和供體細(xì)胞卵周隙注射 固定針輕輕吸住卵母細(xì)胞，用注射針吸出極體以及周圍的部分胞質(zhì)，再將1個(gè)供體細(xì)胞沿剛才的針孔注入卵周隙中。

1.3.5卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞融合以及重構(gòu)胚胎激活 將平衡好的卵母細(xì)胞-供體細(xì)胞復(fù)合物置于2個(gè)電極中間，使去核卵母細(xì)胞和供體細(xì)胞的接觸面平行于2個(gè)電極，最后按開關(guān)進(jìn)行電脈沖處理。

1.3.6重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng) 將重構(gòu)胚胎加入4孔板中，置于5% CO2、38.5℃、100%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.7胚胎移植 在倒數(shù)第1和倒數(shù)第2對乳頭之間切開，將裝好的胚胎移植管，從輸卵管傘部慢慢伸入輸卵管，將卵巢輸卵管還納回腹腔。以生理鹽水沖洗創(chuàng)口后進(jìn)行縫合。

1.3.8代孕受體的妊娠診斷 胚胎移植后26 d左右進(jìn)行B超監(jiān)測妊娠情況，每周進(jìn)行1次B超，追蹤核移植胚胎發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 心臟特異性高表達(dá)PPARγ的西藏小型豬的建立以心臟特異性啟動(dòng)子MYH7啟動(dòng)PPARγ的表達(dá)，并將此轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)入豬胎兒成纖維細(xì)胞，利用此細(xì)胞克隆我們共計(jì)構(gòu)建了1 100枚重構(gòu)胚胎，分別移植到5頭受體豬內(nèi)，經(jīng)B超鑒定3頭懷孕，第1窩生出2個(gè)成活克隆豬，第2窩生出2個(gè)成活克隆豬，第3窩生出4個(gè)成活克隆豬，共計(jì)出生8頭成活克隆豬，經(jīng)PCR鑒定8頭均為陽性豬模型，經(jīng)克隆，獲得了8只克隆豬(表1，圖1)。

表1 MYH7-PPARγ轉(zhuǎn)基因豬出生結(jié)果

圖1 8只MYH7-PPARγ轉(zhuǎn)基因克隆豬照片 A.第1窩;B.第2窩;C.第3窩

2.2 心臟特異性高表達(dá)PPARγ的西藏小型豬的PCR鑒定新生克隆豬在出生后1周剪取耳組織，利用組織基因組提取試劑盒提取克隆豬基因組DNA，以提取的基因組為模板進(jìn)行PCR，經(jīng)PCR鑒定所生的8只豬均是MYH7-PPARγ轉(zhuǎn)基因陽性豬(圖2，3)，可以滿足繼續(xù)試驗(yàn)的需要。

圖2 第1窩所生克隆豬PCR鑒定結(jié)果 M.DNA Marker;1,2.第1窩克隆豬;3.陰性對照;4.目的基因

圖3 第2窩和第3窩所生克隆豬PCR鑒定結(jié)果 M.DNA Marker;1～6.第2,3窩克隆豬;7.目的基因；8.陰性對照

2.3 心肌特異性高表達(dá)PPARγ的蛋白免疫印跡鑒定分別取2只克隆豬和2只同齡對照豬的左、右側(cè)心肌組織，加入RIPA 裂解液含PMSF(Pierce)裂解組織，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎組織,離心取上清，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，進(jìn)行Western blot鑒定，經(jīng)鑒定PPARγ的西藏小型豬在左、右兩側(cè)心肌組織均可高表達(dá)PPARγ(圖4)，可以滿足繼續(xù)試驗(yàn)的需要。

圖4 Western blot鑒定克隆豬心臟中PPARγ表達(dá)情況

2.4 心臟特異性高表達(dá)PPARγ的西藏小型豬的繁殖建系及其鑒定我們將PPARγ的西藏小型豬和WT配種，經(jīng)過114 d的懷孕足月后順產(chǎn)分娩獲得10頭成活F1代仔豬，我們分別在不同位置取耳朵組織并對應(yīng)進(jìn)行編號1～10。利用組織基因組提取試劑盒提取克隆豬基因組DNA,以提取的基因組為模板，進(jìn)行PCR，經(jīng)PCR鑒定所生的10只F1代豬中有8頭是MYH7-PPARγ轉(zhuǎn)基因陽性豬(圖5)，可以滿足繼續(xù)試驗(yàn)的需要。

圖5 心臟特異性高表達(dá)PPARγ小型豬的F1代鑒定結(jié)果 M.DNA Marker;1～10.F1代豬；11.陰性對照；12.水

3 討論

多年來，限制小鼠以外的哺乳動(dòng)物作為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的瓶頸就在于缺少高效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作手段，尤其是基因打靶動(dòng)物。由于在豬等大動(dòng)物中尚未獲得具有生殖系嵌合能力的胚胎干細(xì)胞，使得豬等大動(dòng)物難以通過ES細(xì)胞途徑獲得轉(zhuǎn)基因和基因打靶動(dòng)物，豬等大動(dòng)物的基因編輯長期以來只能依賴于低效率的原核顯微注射法。1997年，體細(xì)胞核移植技術(shù)的成功為豬等大動(dòng)物的基因編輯提供了新的技術(shù)路線。但是目前，哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的效率還很低，依舊受很多因素影響，包括受體卵母細(xì)胞的去核、重構(gòu)胚的融合與激活、核移植方法等。卵母細(xì)胞的去核程度與重構(gòu)胚重編程的狀態(tài)密切相關(guān)，如果能縮短、簡化去核步驟，就可提高效率。目前卵母細(xì)胞去核的方法很多，主要有如下幾種：示核法，傳統(tǒng)的Hoechst33342示核法，可以顯示極體與卵母細(xì)胞中期板的相對位置，從而可以作為判斷去核是否成功的標(biāo)志[10]；盲吸法，利用剛排出的第1極體多位于卵母細(xì)胞核物質(zhì)附近的原理，達(dá)到去核的目的。不需要熒光，也避免了Hoechst33342可能對卵母細(xì)胞的不利影響[11]；化學(xué)法，Etoposide+CHX,DC+CHX,Democolcine+sucrose等組合[12]。這種方法可以成批處理卵母細(xì)胞；離心法，由于卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，極體之間的質(zhì)量不同，可以利用梯度離心法處理，但還沒有見到獲得克隆后代的報(bào)道[13-14]。

轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物模型的研究始于1974年，JAENISCH等[15]第1次嘗試將SV40病毒的DNA 注入小鼠囊胚腔中獲得了嵌合體小鼠，證實(shí)病毒DNA可以整合到宿主基因組中，并在1976年，利用病毒感染胚胎的方式獲得了第1個(gè)攜帶 M-Mu LV病毒基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠品系[16]。1980年，GORDON 等[17]將含有HSV病毒和SV40 病毒DNA的重組質(zhì)粒注入小鼠受精卵的原核中成功獲得2只轉(zhuǎn)基因小鼠，直至目前為止該方法依舊是制備轉(zhuǎn)基因小鼠最經(jīng)濟(jì)、方便的技術(shù)手段。2年后，PALMITER等[18]利用該方法將小鼠 MT-1基因啟動(dòng)子與大鼠 GH基因的融合基因插入小鼠基因組中，成功研制出著名的“超級小鼠”，證實(shí)外源基因可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)。1985年HAMMER等[19]利用原核注射技術(shù)相繼成功獲得了攜帶MT-h GH基因的轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因羊和轉(zhuǎn)基因豬，再次邁出了基因修飾動(dòng)物研究中里程碑式的一步。1997年，英國羅斯林研究院 WILMUT等[20]利用體細(xì)胞克隆技術(shù)成功獲得了克隆羊“多利”，首次證明了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核的全能性，該技術(shù)也為轉(zhuǎn)基因克隆豬的研究開辟了新的途徑。

PPARγ是胰島素敏感的噻唑類藥物(thiazolidinediones，TZDs)的靶標(biāo)之一，TZDs是1組被廣泛用于治療2型糖尿病的藥物。第1個(gè)FDA批準(zhǔn)的TZD類藥物，曲格列酮，由于在病人中出現(xiàn)肝損傷和肝功能衰竭的報(bào)告而被從美國和歐洲市場上撤回。盡管其他的TZD類藥物，羅格列酮和吡格列酮，似乎并沒有類似的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)，但是直到現(xiàn)在，這些藥物的使用仍有別的副作用。由NISSEN等[8]于2007年5月發(fā)表的分析報(bào)告以及其后發(fā)表的1份類似結(jié)論的分析報(bào)告均指出羅格列酮可能增加心肌梗死和心血管病死亡的風(fēng)險(xiǎn)。2個(gè)月后，1個(gè)FDA的委員會確認(rèn)羅格列酮可能具有增加心臟缺血的風(fēng)險(xiǎn)，并于2007年8月起，在TZD類藥物的標(biāo)簽上加了1個(gè)關(guān)于心臟衰竭的黑框警告。因此令我們產(chǎn)生疑問的是：究竟TZD類藥物用于糖尿病人是否安全？它們到底會增加還是減少病人心血管病的風(fēng)險(xiǎn)，或者根本就沒有影響？如果說這些藥物具有心血管疾病方面的副作用，那么其機(jī)制是什么？這些TZD類藥物心血管疾病的副作用是由于其激活了PPARγ引起的呢，還是由于其激活PPARγ的同時(shí)還作用于其他靶標(biāo)引起的所謂脫靶效應(yīng)？這些問題的解決都迫切需要建立糖尿病和心血管病相關(guān)的重要靶點(diǎn)基因PPARγ過表達(dá)轉(zhuǎn)基因克隆豬模型。

本研究建立的模型將提供給美國密歇根大學(xué)陳育慶教授繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的研究，其在PPAR及其他相關(guān)代謝性核受體的心血管作用方面取得了一系列創(chuàng)新性成果，為理解TDZ類II型糖尿病治療藥物的心血管作用以及研究新的糖尿病和心血管治療藥物提供了理論基礎(chǔ)[21-22]。在該模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行的后續(xù)工作對于人類心血管疾病功能基因組學(xué)研究，必將起到重要的推動(dòng)作用，有助于系統(tǒng)地研究PPARγ基因在心血管系統(tǒng)中的功能及其對糖尿病和心血管病的影響。將會對PPARγ基因在心血管系統(tǒng)中的功能有一個(gè)更加全面和深入的認(rèn)識，同時(shí)為PPARγ相關(guān)的糖尿病及心血管病治療新型藥物的開發(fā)提供新的理論依據(jù)和理想動(dòng)物模型。該模型的建立將有助于第1次在與人類更為接近的大動(dòng)物模型中系統(tǒng)的回答TZD藥物在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)的一系列問題，系統(tǒng)地闡明PPARγ基因在心血管系統(tǒng)中的功能及其作用原理，為糖尿病和心血管系統(tǒng)疾病的治療提供理論依據(jù)。 該模型的研究對于糖尿病相關(guān)的心血管系統(tǒng)疾病的研究將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。而且，該模型建立將會為其他靶向PPARγ的新型胰島素激動(dòng)劑藥物的開發(fā)提供理想的動(dòng)物模型。