辛樹陽，嚴(yán)世杰，宋 濤，郝建香，付琦媛，李文傲，王春芳，回衛(wèi)榮，唐夢虎，馬增軍，芮 萍

(河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北秦皇島 066600)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)引起的一種以急性腸胃炎、水樣腹瀉、嘔吐、消瘦和脫水為主要特征的急性、接觸性腸道傳染病[1]。各年齡段豬對該病毒均易感，表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，1周內(nèi)哺 乳仔豬感染尤為嚴(yán)重，發(fā)病率極高，病死率可高達(dá)50%～90%[2-3]。

1984年，我國首次發(fā)現(xiàn)PEDV[4-5]，此后，我國豬場一直存在PEDV感染，但多呈零星分布或地域性流行，并未造成大規(guī)模流行。直至2010年10月，我國華南地區(qū)部分豬場開始暴發(fā)大規(guī)模PED流行，導(dǎo)致數(shù)百萬頭仔豬死亡，短時間內(nèi)疫情迅速擴(kuò)散至全國，甚至在疫苗免疫豬場也有PED疫情暴發(fā)[6]，隨后經(jīng)病毒全基因組測序證實，引起PED疫情暴發(fā)的原因是PEDV 流行毒株發(fā)生變異[7]，此后PED在我國普遍流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究收集了2017—2018年河北省疑似感染PEDV的臨床病料，通過RT-PCR、細(xì)胞培養(yǎng)、測序等進(jìn)行病毒分離鑒定，并利用DNAstar、 MEGA 6.0等軟件與GenBank公布的國內(nèi)外PEDV參考毒株進(jìn)行同源性比對和遺傳進(jìn)化分析， 以期揭示河北省PEDV的流行現(xiàn)狀及遺傳演化情況。

1 材料與方法

1.1 病料采集和處理2017—2018年本實驗室在河北省規(guī)模化養(yǎng)殖場共采集了278份疑似感染PEDV 的病豬臨床樣品，包括小腸及腸道內(nèi)容物等。無菌采集腸道組織和腸道內(nèi)容物于2 mL EP管中， 勻漿破碎后離心收集組織研磨液上清，凍存于-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞、毒株和載體Vero細(xì)胞由本實驗室保存；PEDV陽性對照毒株(CV777，AJ1102株)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室惠贈；CH-HB1-2018株由本實驗室分離保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T Easy Vector購自寶生物工程有限公司。

1.3 主要試劑DEPC購自美國Sigma-Aldrich公司；RNAiso Plus購自大連寶生物公司。Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa Ex Taq?，DL2000 DNA Marker和6×Loading Buffer購自大連寶生物公司；DNA純化試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Alexa Fluor 488-conjugated 驢抗鼠IgG 購自Santa Cruz。

1.4 引物設(shè)計參考PEDV CV777，AJ1102株的S基因序列以及孫倩倩等[8]建立的區(qū)分PEDV經(jīng)典毒株和變異毒株的RT-PCR檢測方法，設(shè)計1個共用上游引物和2個分別針對經(jīng)典毒株和變異 毒株的下游引物(表1)，用于PEDV流行病學(xué)調(diào)查。

表1 擴(kuò)增目的片段引物

1.5 樣品 RNA 提取及 RT-PCR按照試劑盒說明書提取總 RNA，按照 Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書對 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的 cDNA 為模板，擴(kuò)增目的片段，PCR 擴(kuò)增程序為：95℃預(yù) 變性 5 min，95℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

1.7 間接免疫熒光試驗(IFA)將適量 PEDV 分別接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中長成單層 Vero 細(xì)胞，待 60%～70%的細(xì)胞產(chǎn)生 CPE 后收取細(xì)胞樣品，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，室溫下用 4%多聚甲醛固定 15 min，再用預(yù)冷的甲醇透化 10 min。PBS 洗滌 3 次，用含 5%BSA 封閉 30 min，每孔加入適當(dāng)稀釋的抗 N 蛋白單克隆抗體，37℃孵育 1 h，PBS 洗滌 3 次，每孔再加入二抗(Alexa Fluor 488-conjugated 驢抗鼠 IgG)，37℃避光作用 45 min，PBS 洗滌 3 次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 PEDV 全基因組擴(kuò)增、克隆及序列測定參照 AJ1102 株序列，設(shè)計 PEDV 全長引物，見表 2。用該引物對分離毒株 CH-HB1-2018 進(jìn)行全基因擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為：95℃，5 min；95℃，1 min；56℃，1 min；72℃，2 min， 35 個循環(huán)；72℃，10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定后，按照 DNA 膠回收試劑盒說明書對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，并與 pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色菌落搖菌，將鑒定陽性菌液送公司測序。

表2 PEDV 全基因組擴(kuò)增引物

1.9 PEDV 全基因組序列比對和進(jìn)化樹分析利用 DNAstar 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對分析，與 GenBank 中已上傳的國內(nèi)外 PEDV參考毒株全基因序列和 S 基因序列進(jìn)行同源性比對和遺傳進(jìn)化分析，參考毒株信息見表 3。

表3 PEDV 參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測方法驗證按照本研究設(shè)計的 RT-PCR 檢測方法分別對 CV777 經(jīng)典株和 AJ1102 變異株進(jìn)行驗證， PCR 產(chǎn)物經(jīng)由 1%瓊脂糖凝膠電泳試驗鑒定(圖 1)，表明本研究設(shè)計的檢測方法可以有效區(qū)分 PEDV 變異毒株和經(jīng)典毒株。

圖1 RT-PCR 檢測方法驗證結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1.CV777 經(jīng)典株；2.AJ1102 變異株；3.陰性對照

2.1 病料檢測本研究在河北省多個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場共采集 278 份病豬臨床樣品，各地區(qū)采樣及病毒分離情況如圖 2 所示，其中承德、張家口病毒分離率較低，保定、石家莊病毒分離率較高，表明病毒的流行情況可能與當(dāng)?shù)氐纳i養(yǎng)殖密度有關(guān)。本研究設(shè)計的 RT-PCR 診斷方法可以特異性區(qū)分 PEDV 變異毒株和經(jīng)典毒株(圖 3)，利用該對引物對采集的 278 份病豬臨床樣品進(jìn)行 PEDV 檢測。

圖3 PEDV 變異毒株 RT-PCR 鑒別診斷的擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000 DNA Marker；1：PEDV 樣品；2.陰性對照；3.AJ1102 變異株陽性對照；4.CV777 經(jīng)典株陽性對照

圖2 2017—2018 年河北省各地區(qū)PEDV分離情況

2.2 PEDV 毒株的分離鑒定根據(jù)采樣時間、地點等因素選取14份陽性樣品進(jìn)行病原分離，取處理好的組織研磨液上清感染 Vero 細(xì)胞，盲傳 3 代后發(fā)現(xiàn) 3 號樣品在第3代 Vero 接毒樣品中出現(xiàn)明顯 CPE， 收取病毒液后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，最終獲得 1 株能夠在 Vero 細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的 PEDV 毒株。利用PEDV N蛋白單抗作為一抗，通過 IFA 試驗檢測傳代的 PEDV 在 Vero 細(xì)胞上的增殖情況(圖 4A)，進(jìn)而證實成功分離到 1 株 PEDV 毒株，將其命名為 CH-HB1-2018 株。

圖4 PEDV 的間接免疫熒光檢測 A.PEDV 株；B.PEDV 陰性對照；C.PEDV 陽性對照

2.3 PEDV分離毒株全基因組片段擴(kuò)增、克隆及序列拼接通過 RT-PCR，優(yōu)化擴(kuò)增條件，成功擴(kuò)增出 CH-HB1-2018 株全基因組 DNA 片段，各片段大小與預(yù)期相符，將全基因組各片段送公司進(jìn)行測序，利用 DNAstar 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接后獲得 CH-HB1-2018 株的全基因組序列，并提交至 GenBank，登錄號為 MK606368。

2.4 PEDV全基因組序列進(jìn)化樹分析利用 MEGA6.0 軟件繪制 CH-HB1-2018 株與 29 株國內(nèi)外 PEDV 代表毒株全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 5)以分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。30 株 PEDV 序列主要形成 G1，G2，G3 共3個進(jìn)化分支，G1 分支主要由 CV777，SM98 等經(jīng)典毒株組成，G2 分支由 AJ1102，AH2012 等變異毒株組成，G3 分支主要包括 OH851，ZL29 等 SINDEL 毒株。本研究分離毒株CH-HB1-2018 屬于 G2 分支，且與 AJ1102 毒株的遺傳進(jìn)化距離較近。

歌詞一：清明的風(fēng)/吹綠了你的胡同/梨花雨/淋濕了書生的夢/樹葉兒落/頭頂上秋雁呢噥/城門外/沒貼你名字

圖5 PEDV 全基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 ▲表示本研究分離毒株

2.5 PEDV 全基因組序列核苷酸同源性分析通過 MegAlign 軟件對 CH-HB1-2018 株與國內(nèi)外 29 株 PEDV 代表毒株進(jìn)行全基因組序列核苷酸同源性比對(圖6)。結(jié)果顯示，CH-HB1-2018株與中國變異毒株AH2012株和美國變異毒株IA2株的同源性最高，均為99.0%，與AJ1102，LC株等變異毒株的同源性相對較高，在98.0%～99.0%之間，與經(jīng)典毒株的同源性最低，在96.2%～97.5%之間。

圖6 30株毒株全基因組核苷酸同源性比較

2.6 PEDV S基因序列進(jìn)化樹分析S基因在 PEDV 基因組中變異最為明顯，對 CH-HB1-2018 株與 29 株代表株的 S 基因進(jìn)行遺傳演化分析，結(jié)果如圖 7 所示。與全基因組序列進(jìn)化樹相同，30 株 PEDV 的 S 基因分 別形成以經(jīng)典毒株、變異毒株和 SINDEL 毒株為代表的 G1,G2,G3 分支，CH-HB1-2018 株的 S 基因從屬于 G2 分支，與 ZJCJ4 株和 AJ1102 株的遺傳進(jìn)化距離最近。

圖7 S基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 ▲表示本研究分離毒株

2.7 PEDV S 基因序列核苷酸同源性分析利用與全基因組序列比對的相同方法對 30 株 PEDV 毒株的 S 基因進(jìn)行核苷酸同源性比對分析(圖 8)。結(jié)果顯示，CH-HB1-2018 株與經(jīng)典毒株和 SINDEL 毒株 S 基因的同源性分別在 92.5%～94.2%和 94.9%～95.1%之間，與變異毒株 S 基因的同源性在 97.7%～98.9%之間， 其中與 ZJCZ4 株的同源性最高為 98.9%，與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。此外，30 株 PEDV 毒株 S 基因間的同源性顯著低于全基因組序列的同源性，進(jìn)而表明 S 基因變異最為明顯。 核苷酸序列比對結(jié)果顯示，CH-HB1-2018 株與經(jīng)典毒株和 SINDEL 毒株相比在 162,170～180和 413～415 nt 處存在核苷酸插入，在 470～475 nt 處存在核苷酸缺失，與變異毒株的 插入缺失位點一致，表明本研究分離毒株為變異毒株。

圖8 30 株毒株 S 基因核苷酸同源性比較

3 討論

1984年我國在上海首次分離到PEDV，至今已在我國諸多省份廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)乃至公共衛(wèi)生事業(yè)造成巨大的威脅[9]。2010年之后出現(xiàn)的PEDV變異毒株與早期經(jīng)典毒株相比，呈現(xiàn)出致病性更強(qiáng)、流行范圍更廣等特點，因此，急需對PEDV的流行變異情況進(jìn)行密切監(jiān)測。本研究對2017—2018年間在河北地區(qū)采集的278份臨床病料進(jìn)行PEDV檢測，陽性率為19.1%，其中PEDV變異毒株陽性率為17.6%，說明PEDV變異株的流行是當(dāng)前引起豬流行性腹瀉的主要原因。

PEDV只有1種血清型，但很多學(xué)者根據(jù)其全基因組、S基因或M基因?qū)⑵浞譃椴煌种б蕴骄科溥z傳演化規(guī)律[10-14]。PARK等[15]根據(jù)部分S基因序列將其劃分為G1,G2,G3分支；LEE等[16]根據(jù)S基因的全長序列將其劃分為G1,G2兩個分支；CHEN等[17]根據(jù)PEDV全基因組將其劃分為G1,G2,G3共3個分支，其中G3群又被分成4個亞分支。本研究根據(jù)遺傳演化分析結(jié)果將毒株分為了3個分支，分別為以CV777經(jīng)典毒株為代表的G1分支,以IA2,AJ1102等變異毒株為代表的G2分支和以ZL29,OH851等SINDEL毒株為代表的G3分支。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，PEDV流行毒株的地域特點并不顯著，在世界各地均有分布流行，本研究分離毒株CH-HB1-2018株為變異毒株，從屬于G2分支，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前河北地區(qū)PEDV流行毒株以變異毒株為主，但也有經(jīng)典毒株的存在。

SATO等[2]研究發(fā)現(xiàn)，DR13株的S基因在病毒傳代過程中出現(xiàn)多個氨基酸位點的突變或缺失，并且PEDV的S基因存在29個潛在糖基化位點[18]，因此S基因被認(rèn)為與病毒毒力相關(guān)。本研究對30株P(guān)EDV序列的S基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，CH-HB1-2018株存在與變異毒株相同的氨基酸插入、缺失位點，且同源性分析結(jié)果表明S基因的變異程度最大，由此推測S基因在 病毒遺傳演化過程中可能起到重要作用。

本研究通過對病毒的分離鑒定、遺傳演化分析和同源性比對發(fā)現(xiàn)河北省PEDV流行毒株與參考毒株間的同源性較低，提示我們PEDV流行毒株持續(xù)發(fā)生遺傳演化，隨之可能會產(chǎn)生新型變異毒株。此外，S基因的高度變異極有可能增強(qiáng)病毒毒力，致使病毒致病性增強(qiáng)， 對該病毒的防控及公共衛(wèi)生安全都存在巨大的威脅，因此，應(yīng)該對PEDV的流行變異情況進(jìn)行及時且密切的監(jiān)測。本研究為河北省的PEDV流行病學(xué)調(diào)查提供了一定的參考依據(jù)，對該病毒的防控及凈化具有非常重要的現(xiàn)實意義。