夏瓊瓊，鄭興燦，范 波，張文安，王雅雄，李家駒，李鵬峰，郭亞瓊

（中國市政工程華北設計研究總院有限公司，天津300074）

全程自養(yǎng)脫氮（CANON）工藝是一種高效、可持續(xù)性的新型脫氮工藝，該工藝利用氨氧化菌（AOB）將部分NH4+-N 轉化為NO2--N，再利用厭氧氨氧化菌（Anammox）將剩余的NH4+-N 和NO2--N 轉化為氮氣和少量的NO3--N，CANON 工藝通過控制溶解氧（DO）的含量，可以在同一反應器內實現(xiàn)亞硝化所需的有氧環(huán)境和厭氧氨氧化所需的厭氧環(huán)境。CANON 工藝具有不消耗有機碳源、曝氣量較低等優(yōu)點，目前主要應用在污泥消化液、畜禽養(yǎng)殖廢水、垃圾滲濾液等高氨氮、低C/N 比廢水的處理中，工藝的啟動和穩(wěn)定控制是CANON 工藝在工程應用中的主要難點。

由于亞硝化過程為厭氧氨氧化過程提供了基質，所以亞硝化是CANON 工藝運行的基礎，本研究采用先實現(xiàn)亞硝化，再逐漸馴化出厭氧氨氧化菌的試驗方案構建CANON 工藝。亞硝化工藝的關鍵是抑制亞硝酸鹽氧化菌（NOB），將AOB 和Anammox富集在系統(tǒng)中，為此針對亞硝化和CANON 過程的研究大都采用SBR 反應器，而實際工程中連續(xù)流反應器應用更為廣泛。相關研究表明，利用懸浮填料載體培養(yǎng)微生物的移動床生物膜反應器（MBBR），在AOB 和Anammox 的持留方面具有顯著 的 優(yōu)勢〔1-2〕，而且可以連續(xù)運行，降低了運行的難度。筆者借助MBBR 反應器，考察了連續(xù)流情況下反應器的啟動、長期運行和亞硝化向CANON 的轉變過程，探討了亞硝化過程中NO2--N 累積的實現(xiàn)機理以及亞硝化向CANON 轉變的條件。另一方面，目前對于亞硝化和CANON 反應器內部的微生物群體還缺乏全面、深入的了解，針對亞硝化過程從啟動到穩(wěn)定運行到實現(xiàn)轉變期間的功能菌群和種群變化的研究還較少，本研究借助16S rDNA 宏基因組測序方法研究了系統(tǒng)運行不同階段的微生物群落結構特征，為亞硝化工藝和CANON 工藝的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗采用完全混合反應器，由不銹鋼制成，內徑為30 cm，高55 cm，有效容積為32 L。反應器設有可調速攪拌器，底部安裝砂芯曝氣盤，采用空壓機曝氣，曝氣量通過轉子流量計控制，反應器依靠加熱棒保持水溫為（32±1）℃，通過蠕動泵控制進水流量。反應器內裝填懸浮填料（SPR-1 型），尺寸為D 25 cm×10 cm，比表面積為450 m2/m3，填充率為40%。

1.2 試驗用水

試驗用水為自配水，以（NH4）2SO4作為氮源，配水中NH4+-N 質量濃度為120～380 mg/L。按m（HCO3-）∶m（NH4+）為1～1.5 的比例投加NaHCO3作為堿度。模擬 污 水 組 成（mg/L）：KH2PO427、MgSO4·7H2O 300、CaCl2136 和微量元素Ⅰ和Ⅱ各1 mL/L。其中微量元素Ⅰ組成（mg/L）：EDTA 5 000、FeSO45 000。微量元素Ⅱ組 成（mg/L）：EDTA 15 000、ZnSO4·7H2O 430、CoCl2·6H2O 240、MnCl2·4H2O 990、CuSO4·5H2O 250、Na2MoO4·2H2O 220、NiCl2·6H2O 190、Na2SeO4·10H2O 210。

1.3 試驗方案

試驗分為5 個階段，階段Ⅰ～Ⅱ均為低氨氮啟動，進水氨氮濃度較低，階段Ⅲ～Ⅴ進水氨氮濃度較高，運行期間DO 根據(jù)不同進水氨氮濃度進行調整，期間共啟動了兩個反應器，反應器A 共運行了452 d，主要考察進水氨氮濃度對反應器啟動的影響，反應器B 運行了149 d，用于分析亞硝化反應器向CANON反應器轉化的條件。

表1 研究期間反應器運行參數(shù)

1.4 測試指標和方法

NH4+-N 采用納氏試劑比色法；NO2--N 采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；NO3--N 采用紫外分光光度法；TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法；游離氨（FA）的計算方法采用Anthonisen 平衡方程。

1.5 宏基因組測序

2 結果與討論

2.1 反應器的啟動與亞硝化的形成

采用快速排泥掛膜法啟動運行，接種污泥取自天津某污水廠剩余污泥，將污泥和自配污水注入反應器，測得污泥質量濃度約為5.6 g/L，加入填料悶曝24 h 后將混合液排放，然后連續(xù)進水、曝氣。先啟動反應器A，試驗研究了進水NH4+-N 濃度對亞硝化的影響，考察了進水NH4+-N 分別為120～140、180～220、320～380 mg/L 時亞硝化的啟動過程及氮的濃度變化，見圖1、圖2。三種條件下試驗進水pH 均為8.0～8.6，堿度充足，水溫為30～34 ℃。啟動初期為避免填料被沖刷，影響掛膜，采用了較長的HRT，三種條件下HRT 均為48 h，NO2--N 累積率η 按式（1）進行計算。

圖1 不同進水濃度下反應器A 亞硝化的啟動過程

圖2 不同進水濃度下反應器A 中氮濃度的變化

第Ⅰ階段進水NH4+-N 為120～140 mg/L，DO 控制在0.5～0.8 mg/L。從圖1 可以看出，啟動48 d 后，NH4+-N 平均去除率達到61.5%，NO2--N 累積率逐漸升高到24.5%，隨后累積率開始下降，將DO 降低到0.1～0.2 mg/L，仍無法提高累積率，運行至第66 天，NO2--N 累積率沒有超過1%。NO2--N 累積率下降主要是由于系統(tǒng)內NH4+-N 濃度下降過快，維持不了FA 的濃度。FA 對NOB 的抑制質量濃度范圍為0.1～1 mg/L，當FA 的質量濃度達到6 mg/L 時就可完全抑制NOB 的生長〔3〕。根據(jù)出水NH4+-N 濃度和pH 計算出系統(tǒng)內的FA 濃度〔4〕，在啟動初期，F(xiàn)A 約為8.1 mg/L，在第48 天NO2--N 累積率開始下降時，出水NH4+-N 為52.3 mg/L，F(xiàn)A 為3.4 mg/L。

第Ⅱ階段從運行第67 天開始，該階段將進水NH4+-N 提高至180～220 mg/L， 運行至第77 天時，DO 控制在0.8～1.5 mg/L，系統(tǒng)仍沒有出現(xiàn)NO2--N累積，該階段對NH4+-N 的去除率為29%～44%，系統(tǒng)內FA 質量濃度為6.4～8.8 mg/L 仍然較高，所以僅通過FA 無法實現(xiàn)抑制NOB。于是第78 天時將DO降低至0.3～0.6 mg/L，至第91 天—第122 天，系統(tǒng)出現(xiàn)了NO2--N 累積，同時NO3--N 迅速降低，NO2--N累積率達到并維持在90%以上，對NH4+-N 的去除率也逐漸上升，最后達65%左右，表明AOB 菌已生長成熟，并在系統(tǒng)中起主導作用。第123 天—第137天，系統(tǒng)進水配藥泵出現(xiàn)故障，導致進水氨氮降低至130～136 mg/L，將DO 降低至0.1 mg/L，NOB 仍無法抑制，期間出水NH4+-N 和FA 分別為6.5～20.3 mg/L和0.4～1.3 mg/L，系統(tǒng)NO2--N 累積率從93.4%逐漸降低至28.4%。第138 天—第174 天進水NH4+-N 恢復至180～220 mg/L，DO 控制在0.3～0.6 mg/L，NO2--N累積率逐漸提高，但只維持在37%～52%，無法繼續(xù)升高。

在第Ⅰ、第Ⅱ階段的啟動濃度下，試驗沒有實現(xiàn)穩(wěn)定的亞硝化?？梢钥闯?，在系統(tǒng)啟動初期，AOB 菌還沒有生長到一定規(guī)模時，必須保證一定的NH4+-N濃度，否則NOB 將無法被抑制，從本試驗結果來看，出水NH4+-N 必須維持在50 mg/L 以上，但是當進水NH4+-N 較低時，實際運行過程很難保持出水NH4+-N濃度在此范圍，而且系統(tǒng)一旦崩潰向全硝化過程轉變時，也較難恢復。在第Ⅲ階段，將進水NH4+-N 提高至320～380 mg/L，在第186 天—第284 天將DO控制在0.5～0.8 mg/L，運行至第210 天時NO2--N 累積率從初始的18.3%增加至78.9%， 之后維持在80%以上，系統(tǒng)迅速實現(xiàn)了亞硝化，運行至第284天，系統(tǒng)FA 保持在10.3～19.5 mg/L，較高的FA 濃度是實現(xiàn)亞硝化的主要原因。

在第Ⅳ階段將DO 提高至1.0～1.5 mg/L，系統(tǒng)對NO2--N 的累積率一直穩(wěn)定在90%以上，對NH4+-N 的平均去除率提高至60.7%，出水亞硝氮和氨氮比值平均為1.33（見圖1），滿足后續(xù)厭氧氨氧化的進水要求。在第Ⅲ階段實現(xiàn)了穩(wěn)定的亞硝化后，課題內部另一個作為對照的亞硝化反應器B 直接以相同的進水濃度、HRT 和水溫等參數(shù)運行，DO 控制在1.0～1.5 mg/L，該反應器經(jīng)過21 d 的運行實現(xiàn)了穩(wěn)定的亞硝化，并且出水亞硝氮和氨氮比值平均達到了1.42（見后文），驗證了此方法可以快速實現(xiàn)亞硝化，可以看出啟動初期FA 的抑制相對DO 抑制更為重要。

2.2 反應器從亞硝化到CANON 的轉變

第Ⅴ階段期間主要運行參數(shù)未做調整，該期間系統(tǒng)出水氮濃度的變化見圖3。結果顯示系統(tǒng)對TN的去除率逐漸從15.0%增加至72.6%，表明系統(tǒng)逐漸從亞硝化反應器發(fā)展成為一體式CANON 反應器，反應器對TN 的去除負荷達0.16～0.2 kg/（m3·d）。主要原因是， 系統(tǒng)內長期有NO2--N 和NH4+-N 存在，為厭氧氨氧化菌的生長提供了必需的基質。反應器B 在啟動運行期間氮濃度的變化見圖4，結果顯示，反應器B 在快速實現(xiàn)了亞硝化后，經(jīng)149 d 的繼續(xù)運行并沒有出現(xiàn)TN 的去除。主要原因是，DO 直接控制在1.0～1.5 mg/L，實現(xiàn)了較高的氨氮轉化率，出水NO2--N 平均達194 mg/L，一直處于較高的狀態(tài)。研究表明，當NH4+-N 高于100 mg/L 時，厭氧氨氧化菌的活性被完全抑制〔5〕，因此反應器未發(fā)展成為CANON 反應器。在第Ⅲ階段（第186 天—第286 天）反應器A 的DO 為0.5～0.8 mg/L，低DO 運行后反應器NO2--N 僅為11.3～87.1 mg/L，為厭氧氨氧化菌的早期生長創(chuàng)造了條件，在第Ⅳ階段DO 增加后，即使NO2--N 質量濃度達130～246 mg/L，厭氧氨氧化菌也沒有被抑制。

圖3 反應器A 實現(xiàn)穩(wěn)定亞硝化后系統(tǒng)出水氮濃度的變化

圖4 反應器B 啟動運行期間氮濃度的變化

2.3 微生物特征

為進一步研究系統(tǒng)脫氮相關的微生物結構，采用宏基因組測序的方法對種泥和不同時期填料生物膜的生態(tài)結構進行了分析，樣品1 是啟動初期的種泥，樣品2 和樣品3 分別是系統(tǒng)穩(wěn)定亞硝化時期和發(fā)展為CANON 工藝時期取出的填料生物膜，對不同樣品在門和屬水平下的多樣性進行了統(tǒng)計。結果表明，樣品1 主要以變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌 門（Bacteroidetes）、酸 桿 菌 門（Acidobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）為主，相對豐度分別為49.95%、22.33%、12.36%、5.47%，Proteobacteria 和Nitrospirae 是主要的脫氮細菌。 樣品2 和樣品3的微生物主要以變形菌門（Proteobacteria）、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等為主。樣品2中相對豐度分別為36.04%、21.73%、17.89%、3.60%、3.89%，樣品3 中相對豐度分別為49.31%、17.40%、13.39%、3.92%、2.50%。樣品2 和樣品3 中占比最豐富的菌群為Proteobacteria，Proteobacteria 是污水處理系統(tǒng)中的主要脫氮菌群，反應器從亞硝化狀態(tài)轉變?yōu)镃ANON 狀態(tài)時，Proteobacteria 變化最為顯著。Chlorobi 和Chloroflexi 在樣品2 和樣品3 中也占據(jù)了較大比例，這和其他研究的結果是一致的〔6-7〕，該類細菌和脫氮菌成共生關系，其代謝產(chǎn)物促進了厭氧氨氧化菌的生長〔8-9〕。

圖5 是樣品中主要脫氮菌屬的相對豐度。

圖5 主要脫氮菌屬相對豐度

可以看出，啟動初期的樣品1 硝化菌屬包括Nitrosomonadaceae（相對豐度為0.35%）、Nitrosospira（相對豐度為2.53%）、Nitrosomonas （相對豐度為0.76%）、Nitrospira（相對豐度為5.47%），前三種均為AOB 菌屬，后一種為NOB 菌屬。樣品2 和樣品3 中的硝化菌屬均只有Nitrosomanas（相對豐度分別為13.81%和27.78%），表明NOB 被系統(tǒng)淘汰。對比樣品2 和樣品3，反應器從亞硝化狀態(tài)轉變?yōu)镃ANON狀態(tài)時，Nitrosomona 的相對豐度提高了1 倍多，Nitrosomona 是亞硝化過程最重要的功能菌屬，表明隨著狀態(tài)的改變，整個系統(tǒng)的亞硝化穩(wěn)定性趨向更好。

在屬水平上選擇厭氧氨氧化菌所在的Planctomycetes 門進行分析，結果顯示，其中的Candidatus_Brocadia、Candidatus_Jettenia、Candidatus_Kuenenia、Candidatus_Scalindua 屬是具有厭氧氨氧化功能的菌屬。反應器從亞硝化狀態(tài)轉變?yōu)镃ANON 狀態(tài)時，Candidatus_Jettenia 占比從30.96%降低至1.66%，Candidatus_Kuenenia 則從32.13%升高至67.47%。研究表明， 與其他厭氧氨氧化菌屬相比，Candidatus_Jettenia 對亞硝酸鹽的耐受性更高〔10〕，而Candidatus_Kuenenia 適合存在于低基質濃度污水中〔11〕。在亞硝化狀態(tài)時，系統(tǒng)內亞硝酸鹽濃度較高，Candidatus_Jettenia 比例較高，而CANON 狀態(tài)系統(tǒng)整體基質濃度較低，Candidatus_Kuenenia 則成為主要菌屬。

3 結論

（1）在連續(xù)流反應器內投加懸浮填料作為生物載體，富集培養(yǎng)亞硝化細菌，可以成功實現(xiàn)NO2--N的累積。在進水NH4+-N 為320～380 mg/L，溫度為30.2～34.5 ℃的條件下， 控制HRT 為48 h、DO 為1.0～1.5 mg/L、pH 為8.0～8.6，系統(tǒng)對NO2--N 累積率達90%以上，對NH4+-N 平均去除率為60.7%，出水NO2--N 和NH4+-N 比值平均為1.33，采用該方法可在21 d 內實現(xiàn)穩(wěn)定的亞硝化。

（2）懸浮載體生物膜反應器達到穩(wěn)定亞硝化狀態(tài)后維持較低的DO， 將系統(tǒng)NO2--N 控制在100 mg/L 以下，可以逐漸轉變?yōu)镃ANON 反應器。試驗期間系統(tǒng)在實現(xiàn)亞硝化的基礎上，又運行164 d 后對TN 的去除率從15.0%增加至72.6%，亞硝化期間的低DO 運行為CANON 系統(tǒng)中厭氧氨氧化菌的生長創(chuàng)造了條件。

（3）系統(tǒng)啟動后微生物種群發(fā)生了較大變化，其中變形菌門（Proteobacteria）、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）是啟動后的優(yōu)勢菌群，Proteobacteria 和Planctomycetes 是主要的脫氮菌群。脫氮菌屬的數(shù)據(jù)表明，啟動后NOB 菌屬Nitrospira 被逐漸淘汰，AOB 菌屬Nitrosomonas 成為優(yōu)勢菌屬。系統(tǒng)從亞硝化轉變?yōu)镃ANON 狀態(tài)時，Nitrosomona 屬的相對豐度顯著增加，Candidatus Kuenenia 成為Planctomycetes 門的主要菌屬。