張林琳，施紹瑞，代云才

(宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科遺傳室，四川 宜賓 644000)

染色體是細(xì)胞核中載有遺傳信息的物質(zhì)，胎兒染色體異常可能導(dǎo)致自發(fā)性流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育、胚胎發(fā)育畸形、新生兒早夭、新生兒出生缺陷等，而經(jīng)過羊水細(xì)胞培養(yǎng)獲得胎兒染色體核型的準(zhǔn)確性可達(dá)99%。因此產(chǎn)前診斷羊水染色體核型分析對于優(yōu)生優(yōu)育、降低出生缺陷、提高人口素質(zhì)具有十分重要的指導(dǎo)意義。做好產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷發(fā)生率，預(yù)防染色體異常胎兒出生的有效措施[1]?，F(xiàn)將2014年1月至2018年8月來我院就診的4 500例孕婦羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性分析。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年1月至2018年8月在宜賓市第二人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷科就診，經(jīng)過遺傳咨詢并簽署知情同意書后，進(jìn)行羊膜腔穿刺的孕婦，包括符合產(chǎn)前診斷指征，如高齡孕婦(預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲)、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒結(jié)構(gòu)或其他軟指標(biāo)發(fā)育異常、曾有過不良孕產(chǎn)史、夫婦一方染色體異常等，以及無產(chǎn)前診斷指征而自愿要求進(jìn)行羊膜腔穿刺的孕婦。孕婦就診時的年齡為15歲至47歲，孕周為18周至25周。

1.2 方法

在產(chǎn)前診斷科手術(shù)室，先用B超定位，然后常規(guī)嚴(yán)格無菌操作消毒行羊膜腔穿刺術(shù)，先抽取1～2mL羊水棄去，以避免母體細(xì)胞污染，再抽取20～30mL羊水分別注入兩支15mL無菌離心管中。將標(biāo)本小心轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室，放入離心機(jī)中，用1 800轉(zhuǎn)/分進(jìn)行10分鐘離心，嚴(yán)格無菌環(huán)境中去上清，留0.5mL羊水細(xì)胞混懸液，加入兩種不同批號的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)入專用羊水細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別放入兩個獨(dú)立的37℃恒溫的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。一周后視羊水細(xì)胞生長情況而換液，之后繼續(xù)觀察，如見到較多較大的克隆細(xì)胞貼壁生長，且克隆細(xì)胞中有較多的圓形細(xì)胞時即可收獲并制片，待標(biāo)本片老化后用牛胰蛋白酶消化G顯帶，吉姆薩染液染色。之后于常規(guī)顯微鏡下計(jì)數(shù)30個分散良好的分裂相(如果發(fā)現(xiàn)嵌合體，則加倍計(jì)數(shù))，用染色體核型分析軟件采集圖像，選取5個以上較好的分裂相進(jìn)行染色體核型分析。羊水染色體核型結(jié)果依據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判別[2]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，各組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1染色體異?？傮w情況

本研究共統(tǒng)計(jì)4 500例羊水細(xì)胞培養(yǎng)，其中培養(yǎng)成功4 456例，成功率為99.02%；檢出異常核型143例，異常率為3.18%。

2.2異常染色體核型分布情況

4 500例羊水細(xì)胞共檢出異常染色體核型143例，具體分布情況見表1。143例異常核型中，染色體數(shù)目異常的有116例，占比81.12%。其中，三倍體綜合征1例，占比0.70%；21-三體綜合征68例，占比47.55%；18-三體綜合征18例，占比12.59%；性染色體數(shù)目異常29例，占比20.28%。染色體結(jié)構(gòu)異常27例，占比18.88%。其中，平衡易位10例，占比7.00%；羅伯遜易位6例，占比4.20%；倒位1例，占比0.70%；額外未知來源的物質(zhì)2例，占比1.40%；缺失1例，占比0.70%；重復(fù)1例，占比0.70%；其他6例，占比4.20%。數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=237.54，P<0.05)。

表1 4 500例孕婦羊水染色體異常情況(%) Table 1 Types and detection rate of chromosome abnormalities in amniotic fluid of 4 500 pregnant women (%)

2.3不同產(chǎn)前診斷指征的異常核型檢出情況

4 500例羊水染色體核型中，高齡孕婦1 590例，檢出異常核型70例，檢出率為4.40%；血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)2 602例，檢出異常核型61例，檢出率為2.34%；產(chǎn)前超聲示胎兒發(fā)育異常53例，檢出異常核型1例，檢出率為1.89%；曾有過不良孕產(chǎn)史70例，檢出異常核型3例，檢出率為4.29%；夫婦一方染色體異常18例，檢出異常核型7例，檢出率為38.89%；無產(chǎn)前診斷指征而自愿要求者167例，檢出異常核型1例，檢出率為0.60%。各類指征核型異常檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=361.87，P<0.05)，見表2。

表2 羊水染色體異常的高危因素與異常核型分析[n(%)]Table 2 Analysis of high risk factors and abnormal karyotypes of amniotic fluid chromosome abnormality [n(%)]

3討論

3.1羊水染色體異常核型種類分析

目前，我國新生兒出生缺陷的發(fā)生率有逐漸增高的趨勢，究其原因，一方面，隨著我國二胎政策的全面放開，涌現(xiàn)出大量高齡孕婦追生二胎；另一方面，由于環(huán)境污染以及基因的變異因素導(dǎo)致。多數(shù)出生缺陷的具體原因尚無法準(zhǔn)確得知，但是已知有很多因素可以造成出生缺陷的發(fā)生，其中環(huán)境因素約占10%，遺傳因素約占25%，環(huán)境因素與遺傳因素相互作用和原因不明者約占65%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國每年出生染色體異常的新生兒約10萬人，在活體嬰兒中染色體異常約占0.5%。高危孕婦中胎兒染色體異常發(fā)生率為3.1%～3.99%。本資料絕大部分是具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦，染色體異常達(dá)96.29%，提示妊娠中期行產(chǎn)前診斷非常重要。我院已開展產(chǎn)前診斷技術(shù)11年，到目前為止只發(fā)現(xiàn)了唯一1例三倍體綜合征。該孕婦因發(fā)現(xiàn)胎兒多發(fā)畸形而行羊膜腔穿刺，結(jié)果證實(shí)胎兒染色體核型為69，XXX。人類三倍體較為罕見，是三組完整的染色體代替了正常的兩組染色體，染色體總數(shù)達(dá)69條，屬于嚴(yán)重的染色體數(shù)目異常疾病中的整倍性改變。三倍體綜合征的發(fā)生機(jī)理根據(jù)受精方式的不同，分為雙雄受精、雙雌受精和正常受精后有絲分裂染色體分離失調(diào)[3]。目前尚未發(fā)現(xiàn)三倍體與孕婦高齡有關(guān)，三倍體再發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)率與正常人群中三倍體發(fā)現(xiàn)的頻率相同。因99%的三倍體綜合征胎兒都不能妊娠至足月，且新生兒并發(fā)癥多，死亡率高，應(yīng)盡早確診，故產(chǎn)前診斷尤為重要。本統(tǒng)計(jì)的異常核型中，常染色體三體型是最為常見的，尤其21-三體最多見，占47.55%，其次是18-三體，占12.59%。至今尚未發(fā)現(xiàn)13-三體，可能系13-三體更為嚴(yán)重，難以存活至孕中期，在孕早期即可能發(fā)生流產(chǎn)、死胎等情況所致。一般認(rèn)為三體綜合征的發(fā)生是染色體畸變引起的，由于3條染色體載有相同的基因，破壞了遺傳物質(zhì)間的平衡，導(dǎo)致胎兒染色體異常[4]。21-三體綜合征，也稱唐氏綜合征，是人類足月新生兒最常見的染色體病，其發(fā)病率在活產(chǎn)新生兒中為1/(600～800)。唐氏綜合征在不同國家不同患者之間存在不同的臨床表型[5]。唐氏綜合征是一種偶發(fā)性的染色體疾病，即使夫婦雙方染色體正常，也有生育唐氏綜合征患兒的可能性。而且所有年齡段的孕婦都有可能生育唐氏綜合征患兒，但是高齡孕婦生育唐氏綜合征患兒的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)21-三體綜合征的原因是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂時21號染色體不分離，90%來源于母親，母親妊娠時的年齡是明確的影響因素之一。隨著女性年齡的增長，卵子會逐漸老化、質(zhì)量下降，加之承受環(huán)境污染、輻射等各種有害物質(zhì)的累計(jì)效應(yīng)，卵細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生染色體不分離或斷裂的幾率增高，致使高齡孕婦生育唐氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)也大大增加。另有研究者認(rèn)為，除了年齡因素以外，應(yīng)該還存在著其它因素導(dǎo)致21號染色體不分離，低齡孕婦生育唐氏綜合征患兒的主要原因可能為遺傳易感性，其易感因素為葉酸代謝相關(guān)酶基因突變。當(dāng)母體內(nèi)葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性導(dǎo)致葉酸代謝異常時，可能導(dǎo)致與代謝相關(guān)的基因突變，并且影響21號染色體的重組和分離關(guān)鍵區(qū)域的甲基化模式，成為發(fā)生21-三體綜合征的高危因素。其次較為常見的異常核型是性染色體數(shù)目異常，有29例，占比為20.28%，其中有19例為高齡孕婦，具體核型包括47，XXX、47，XXY、47，XYY、45，X。另有2例性染色體結(jié)構(gòu)異常，均為高齡孕婦，核型分別為：46，X，del(X)(p21)、46，X，psu idic(X)(q28)。換言之，性染色體異常的總例數(shù)為31例，占比21.68%，其中高齡孕婦有21例。性染色體異常是一種較為常見的染色體疾病，可導(dǎo)致內(nèi)、外生殖器異?；蚧?，女性可表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)、反復(fù)自然流產(chǎn)、不孕等，男性可表現(xiàn)為不育、無精子癥等。高齡孕婦由于卵子老化、質(zhì)量下降，以及環(huán)境不利因素的累加效應(yīng)，卵細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中發(fā)生不分離的幾率增高，可產(chǎn)生染色體數(shù)目異常的卵子，這種染色體數(shù)目異常的卵子與正常的精子結(jié)合后，就會形成染色體異常的胎兒[6]。因此高齡孕婦不僅可導(dǎo)致胎兒常染色體異常，而且胎兒性染色體異常的概率也會隨著孕婦年齡的增長而逐漸增加。染色體結(jié)構(gòu)異常方面，較多見的是平衡易位，有10例，占比為7.00%；其次是羅伯遜易位，有6例，占比為4.2%；此外，還分別有倒位1例、額外未知來源的物質(zhì)2例、缺失1例、重復(fù)1例。造成染色體結(jié)構(gòu)畸變的原因是多方面的，通?？捎呻婋x輻射、誘變劑等理化因素和病毒等生物因子誘發(fā)產(chǎn)生。染色體結(jié)構(gòu)畸變可分為穩(wěn)定型和非穩(wěn)定型兩大類，穩(wěn)定型的染色體結(jié)構(gòu)畸變能夠穩(wěn)定地通過細(xì)胞有絲分裂而傳給子代細(xì)胞。因此，以夫婦一方染色體異常為產(chǎn)前診斷指征的孕婦，其異常核型檢出率最高，達(dá)38.89%。對于此類孕婦，產(chǎn)前診斷檢查胎兒染色體顯得尤為重要。

3.2不同產(chǎn)前診斷指征的異常核型檢出情況

產(chǎn)前診斷指征方面，本統(tǒng)計(jì)中行羊膜腔穿刺的最常見指征為高齡孕婦和血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)，分別占穿刺總?cè)藬?shù)的35.33%和57.82%，其他指征包括：產(chǎn)前超聲示胎兒發(fā)育異常、曾有過不良孕產(chǎn)史、夫婦一方染色體異常等，另有一部分孕婦系無產(chǎn)前診斷指征而自愿要求。不同產(chǎn)前診斷指征下的異常核型結(jié)果具體為：高齡孕婦共1 590例，占比35.33%，其中異常核型70例，檢出率為4.40%；血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)共2 602例，占比57.82%，其中異常核型61例，檢出率為2.34%；產(chǎn)前超聲示胎兒發(fā)育異常共53例，占比1.18%，其中異常核型1例，檢出率為1.89%；曾有過不良孕產(chǎn)史共70例，占比1.56%，其中異常核型3例，檢出率為4.29%；夫婦一方染色體異常共18例，占比0.40%，其中異常核型7例，檢出率為38.89%；無產(chǎn)前診斷指征而自愿要求者共167例，占比3.71%，其中異常核型1例，檢出率為0.60%。值得注意的是，因夫婦一方染色體異常而行羊膜腔穿刺的孕婦共18例，而檢出的胎兒染色體異常有7例，檢出率達(dá)到38.89%，可見，夫婦一方染色體異常的胎兒染色體異常檢出率最高。對于該類人群，必須及時進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以明確胎兒染色體是否異常。此外，Yu等[7]研究報(bào)道曾有過不良孕產(chǎn)史夫婦的胎兒染色體異常率高達(dá)7.4%，本統(tǒng)計(jì)中曾有過不良孕產(chǎn)史的胎兒異常檢出率為4.29%，也顯著高于其他多項(xiàng)產(chǎn)前診斷指征。因此，曾有過不良孕產(chǎn)史也是進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷的高危指征之一。另外，前已述及，高齡孕婦可引起胎兒染色體出現(xiàn)包括數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常等各種問題，且隨著孕婦年齡的增加，胎兒出現(xiàn)染色體異常的幾率也隨之增大。其發(fā)生機(jī)制可能與卵母細(xì)胞老化，以致在減數(shù)分裂時發(fā)生不分離的概率增加有關(guān)，且高齡可作為一個獨(dú)立的產(chǎn)前診斷指征[8]。因此，高齡孕婦是胎兒染色體異常的高危人群，必須引起足夠的重視，做好相應(yīng)的產(chǎn)前診斷工作。而無產(chǎn)前診斷指征而自愿要求者，其胎兒染色體異常檢出率最低，僅0.60%。由此可見，產(chǎn)前診斷指征是非常重要的。對于具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦來說，一定要嚴(yán)格遵醫(yī)囑，及時行羊膜腔穿刺檢查以明確胎兒染色體核型，盡可能避免染色體異?；純撼錾?。

綜上所述，妊娠中期羊膜腔穿刺羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析是目前開展最廣泛、有效、安全的產(chǎn)前診斷技術(shù)，凡是具備產(chǎn)前診斷指征的孕婦都應(yīng)該及時進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析，這樣才能明確判斷胎兒染色體核型正常與否，從而有效預(yù)防染色體異常胎兒出生，降低新生兒出生缺陷發(fā)生率，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)的目的。