張育珍，何家垣，蔣壯飛，馬蓉蓉，張起輝**

(1．西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2．重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400044)

白頭翁[Pulsatillachinensis(Bge.)Regel]是一種傳統(tǒng)的常用中草藥，為毛茛科白頭翁屬植物，因其在清熱、涼血、排毒、抗腸道阿米巴痢疾以及細(xì)菌感染中的顯著作用而被廣泛使用[1-4]。近期研究表明，白頭翁中代表性成分白頭翁皂苷B4(AB4)具有良好的生物活性，包括抗氧化、抗癌等[5-7]。但是目前AB4分離和預(yù)富集的方法主要集中在柱色譜和制備液相上，這些純化方法需要昂貴的儀器或消耗大量有機(jī)溶劑以達(dá)到檢測(cè)和富集目的，會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物回收率下降，并且花費(fèi)大量時(shí)間在樣品前處理上，導(dǎo)致AB4標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴[8-9]。簡(jiǎn)單、快速的從復(fù)雜天然產(chǎn)物中分離得到其有效成分，一直是人們面臨的難題。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種在空間結(jié)構(gòu)上對(duì)特定分子具有識(shí)別性能的聚合物[10]，具有穩(wěn)定性好、選擇識(shí)別性高等特點(diǎn)[11]，已經(jīng)在很多領(lǐng)域包括固相萃取[12-14]、人造傳感器[15-17]、藥物分析[18-21]等有廣闊的應(yīng)用前景。磁性表面分子印跡聚合物(MMIPs)具有殼-核結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點(diǎn)位于印記表面，因此模板分子吸附和解吸速率快，而且結(jié)合磁性響應(yīng)，只需磁控分離聚合物而不需要離心、過濾等冗雜操作[13]。多巴胺(DA)是一種含有鄰苯二酚和氨基官能團(tuán)小分子化合物，在弱堿環(huán)境中，其通過自聚合形成具有黏附能力的化合物聚多巴胺(PDA)[22]。Chen等[23]以DA為功能單體合成了印跡材料并用于蛋白質(zhì)的預(yù)富集，Zhou等[24]利用DA自聚合形成PDA包裹在四氧化三鐵(Fe3O4)上，用于模板蛋白的識(shí)別。因此，期望基于DA為功能單體和交聯(lián)劑合成一種綠色、低成本的印記材料。然而，有些天然產(chǎn)物價(jià)格非常昂貴，這阻礙了印跡材料的發(fā)展。目前，以偽模板合成的印跡材料成功解決了模板不易洗脫、模板滲漏以及AB4作為模板分子昂貴的問題[25]。

作者采用表面分子印跡的方法，以磁性納米材料Fe3O4作為支撐材料，鼠李糖(Rha)作為模板，DA·HCl作為功能單體和交聯(lián)劑，制備出能識(shí)別糖苷配基的磁性分子印跡聚合物(Rha-MMIPs)。隨后對(duì)Rha-MMIPs進(jìn)行表征，并結(jié)合高效液相(HPLC)用于中藥白頭翁中AB4定向預(yù)富集研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料試劑與儀器

白頭翁藥材：購買于北京同仁堂，經(jīng)重慶大學(xué)張起輝副教授鑒定為白頭翁藥材。

AB4：純度≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；鹽酸·多巴胺(DA·HCl)、鼠李糖(Rha)：純度≥98%，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，市售。

掃描電子顯微鏡(SEM)：merlin compact，德國蔡司公司；透射電子顯微鏡(TEM)：JEM 2100F，日本JEOL公司；傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：IR-Affinity-1，日本島津公司；熱重分析儀：TGA/DSL1/1600LF，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色譜儀(HPLC)：安捷倫1260，美國安捷倫公司。

1.2 磁性分子印跡材料(Rha-MMIPs)制備

首先通過水熱法制備Fe3O4納米粒子(Fe3O4NPs)[26-27]，步驟如下。向乙二醇中加入1.35 g六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)；隨后加入3.1 g無水醋酸鈉(NaAc)和0.4 g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7)，200 ℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，反復(fù)洗滌產(chǎn)物Fe3O4NPs直至中性，真空干燥8 h。隨后將75 mg Fe3O4分散于30 mL三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl，pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，超聲混勻，然后向溶液中加入75 mg模板分子Rha，在搖床上震蕩0.5 h。隨后將75 mg功能單體DA·HCl緩慢加入上述溶液中于30 ℃暗室反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，磁控收集聚合物，用V(乙腈)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液洗脫模板分子，隨后用無水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌Rha-MMIPs直至中性，45 ℃真空干燥6 h。磁性分子印跡材料Rha-MMIPs合成步驟見圖1。

圖1 Rha-MMIPs合成及實(shí)際應(yīng)用示意圖

在不添加模板分子的情況下，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟制備非印跡聚合物Rha-MMIPs，作為對(duì)照。

1.3 吸附實(shí)驗(yàn)

1.3.1 吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將AB4標(biāo)準(zhǔn)品(結(jié)構(gòu)式見圖2)溶于Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，配置一系列AB4標(biāo)準(zhǔn)溶液(10、20、40、60、80、100 μg/mL)，分別將15 mg的Rha-MMIPs/Rha-MNIPs添加到AB4標(biāo)準(zhǔn)溶液中，隨后將混合物放置在90 r/min、30 ℃搖床上反應(yīng)。4 h后，磁控分離得到上清液。用HPLC測(cè)定峰面積，對(duì)照AB4標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附后溶劑的濃度。平衡時(shí)吸附量Q按照公式(1)計(jì)算。

圖2 AB4結(jié)構(gòu)式

Q=(ρ0-ρe)×Vm

(1)

式中：Q為Rha-MMIPs或Rha-MNIPs對(duì)目標(biāo)化合物的吸附量，mg/g；ρ0為AB4初始質(zhì)量濃度，μg/mL；ρe為平衡時(shí)上清液中AB4質(zhì)量濃度，μg/mL；V為吸附體積，mL；m為聚合物的質(zhì)量，mg。

1.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將15 mg印記聚合物Rha-MMIPs/Rha-MNIPs加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在90 r/min、30 ℃搖床上分別反應(yīng)5、10、20、30、40、60、90、120 min。不同時(shí)間段在磁場(chǎng)作用下分離，得到上清液。隨后用微孔濾膜過濾并利用HPLC定量分析，并計(jì)算上清液中ρ(AB4)。Rha-MMIPs或Rha-MNIPs的吸附量由式(1)計(jì)算。

1.4 Rha-MMIPs重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

重現(xiàn)性是影響印跡聚合物應(yīng)用非常重要的因素。在相同的條件下，合成6批印跡材料，每批聚合物取15 mg，加入ρ(AB4)=80 μg/mL溶液中，在搖床上，以90 r/min的轉(zhuǎn)速、30 ℃反應(yīng)60 min，隨后利用磁場(chǎng)進(jìn)行分離，取上清液過濾，并用HPLC定量計(jì)算上清液中ρ(AB4)。按照公式(1)計(jì)算6批Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附性能，從而評(píng)價(jià)Rha-MMIPs的重現(xiàn)性。

1.5 磁性分子印跡材料的實(shí)際應(yīng)用

1.5.1 白頭翁提取

每次加入200 mLφ(乙醇)=70%溶液于20 g白頭翁粉末中分別提取3次，合并濾液，隨后用等體積石油醚萃取3次，濃縮下層溶液得浸膏。隨后浸膏用甲醇溶解待用。接著用活化好的D101大孔樹脂分離，收集φ(乙醇)=50%洗脫液，濃縮得浸膏并用甲醇溶解，得到ρ(甲醇)=50 mg/mL溶液。

1.5.2 磁性分子印跡材料的實(shí)際應(yīng)用

取上述甲醇溶液3 mL并用N2吹干，加入3 mL Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液復(fù)溶。之后向溶液中加入15 mg Rha-MMIPs，將混合物在振蕩器上以90 r/min的轉(zhuǎn)速、30 ℃反應(yīng)60 min，用HPLC檢測(cè)吸附前以及洗脫液中ρ(AB4)。

1.6 色譜條件

色譜柱為TC C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫，0～6 min 30%～35% B，6～8 min 35%～100% B，8～12 min 100%～100% B，12～15 min 100%～30% B，流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)201 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 Rha-MMIPs的SEM和TEM

Fe3O4NPs、Rha-MMIPs的SEM和TEM見圖3。

a Fe3O4 NPs的SEM圖

由圖3a可知，F(xiàn)e3O4NPs呈球形顆粒、分散性較好、粒徑均一，可以作為基質(zhì)材料。由圖3b可知，印跡層包裹在基質(zhì)材料上，表面相對(duì)粗糙、分散性好、大小均勻。由圖3c和圖3d可知，Rha-MMIPs殼-核結(jié)構(gòu)明顯，其中Fe3O4NPs直徑約200 nm，其外面包裹的印跡層約40 nm，表明已經(jīng)成功制備出殼-核結(jié)構(gòu)的印記聚合物。

2.2 Rha-MMIPs的結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 紅外光譜表征

采用紅外光譜表征Rha-MMIPs鍵合情況，結(jié)果見圖4。

σ/cm-1

2.2.2 熱重表征

采用熱重分析儀表征聚合物的熱穩(wěn)定性，Rha-MMIPs熱重分析見圖5。

t/℃

由圖5可知，當(dāng)溫度達(dá)到130 ℃，Rha-MMIPs質(zhì)量減少3.04%，主要由于印記材料中水分的蒸發(fā)。當(dāng)溫度升高至340 ℃，其質(zhì)量一直在減少，質(zhì)量損失達(dá)到14.27%，這可能由于Rha-MMIPs表面印跡層以及有機(jī)成分的分解。結(jié)果表明Rha-MMIPs在130 ℃以內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.2.3 樣品磁性分析

Rha-MMIPs的磁性分離效果圖見圖6。

a Rha-MMIPs在溶液中分散圖

由圖6a可知，Rha-MMIPs在Tris-HCl(pH=8.5，10 mmol/L)溶液中，分散性較好，沉淀速度緩慢；在外加磁場(chǎng)作用下，Rha-MMIPs能快速(30 s)聚集到瓶壁，與溶液分開(見圖6b)。這表明Rha-MMIPs具有一定的磁性，并且能達(dá)到磁性分離的效果，可以用于復(fù)雜樣品中磁控分離。

2.3 Rha-MMIPs的吸附性能分析

2.3.1 Rha-MMIPs的等溫吸附特性

Rha-MMIPs和Rha-MNIPs的等溫吸附曲線見圖7a。由圖7a可知，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs吸附量隨著初始質(zhì)量濃度的增加而增加。ρ(Rha-MMIPs)=80 μg/mL時(shí)，吸附能力達(dá)到5.80 mg/g，明顯大于Rha-MNIPs最大吸附量。這主要由于Rha-MMIPs表面吸附位點(diǎn)提高了其對(duì)AB4的吸附能力。而Rha-MNIPs的吸附能力是由聚多巴胺引起的。

利用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型對(duì)靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

Langmuir等溫吸附模型見式(2)。

ρeQ=1QmaxKL+ρeQmax

(2)

Freundlich等溫吸附模型見式(3)。

logQ=mlogρe+logKF

(3)

式中：Qmax為飽和吸附量，mg/g；KL為L(zhǎng)angmuir等溫方程的平衡常數(shù)，mL/mg；擬合結(jié)果見圖7b。KF為Freundlich等溫吸附模型的平衡常數(shù)，mg/g；m為Freundlich等溫吸附模型的非均質(zhì)性指數(shù)。

ρ/(μg·mL-1)a 等溫吸附曲線

平衡常數(shù)和相關(guān)系數(shù)見表1。

由表1可知，Langmuir等溫吸附模型更適合Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附性能，其R2(0.998 2)高于Freundlich等溫吸附模型，表明Rha-MMIPs與AB4屬于單層吸附結(jié)合，可能源于材料表面空穴是均勻的。

表1 Langmuir等溫吸附模型和Freundlich等溫吸附模型參數(shù)

2.3.2 Rha-MMIPs的動(dòng)力學(xué)特性

對(duì)Rha-MMIPs和Rha-MNIPs進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果見圖8。

t/mina 吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖8a可知，隨著吸附時(shí)間增加，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs對(duì)AB4的吸附量也隨之增加，當(dāng)吸附時(shí)間為60 min，Rha-MMIPs和Rha-MNIPs均達(dá)到吸附平衡。此外，Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附量遠(yuǎn)高于Rha-MNIPs，這說明Rha-MMIPs對(duì)AB4具有更大的親和力。

為了進(jìn)一步研究Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附動(dòng)力學(xué)，對(duì)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬，相關(guān)參數(shù)見表2。準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線見圖8b。由表2可知，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)具有較高的相關(guān)系數(shù)，更符合Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附。這也進(jìn)一步表明，化學(xué)吸附是Rha-MMIPs吸附過程中的決速步驟。

準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程見式(4)。

ln/(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(4)

準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程見式(5)。

tQt=1K2Q2e+tQe=1v0+tQe

(5)

式中：Qe和Qt分別為在平衡和時(shí)間t(min)時(shí)吸附劑的吸附容量，mg/g；v0為初始吸附速率， mg/(g·min)；K1為準(zhǔn)一級(jí)方程的平衡速率常數(shù)， min-1；K2為準(zhǔn)二級(jí)方程的平衡速率常數(shù)，g/(mg·min)。

表2 Rha-MMIPs模擬的兩種動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 Rha-MMIPs的重現(xiàn)性

不同批次Rha-MMIPs的吸附量見圖9。

批次

由圖9可知，相同條件下不同批次Rha-MMIPs對(duì)AB4的吸附量基本相同，表明Rha-MMIPs具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，Rha-MMIPs可以作為固相萃取劑廣泛應(yīng)用。

2.5 Rha-MMIPs的應(yīng)用

白頭翁中的AB4經(jīng)Rha-MMIPs吸附前以及Rha-MMIPs洗脫液液相色譜圖見圖10。通過AB4標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖可知在保留時(shí)間約為8.0 min為AB4色譜峰。比較吸附前以及洗脫液色譜峰發(fā)現(xiàn)，AB4色譜峰變化很大，表明AB4已被Rha-MMIPs吸附，而白頭翁中其他物質(zhì)峰面積基本保持不變，這可能因?yàn)锳B4糖鏈末端為Rha以及印記空穴大小和氫鍵作用。因此實(shí)驗(yàn)制得的Rha-MMIPs可從白頭翁粗提物中預(yù)富集AB4，可廣泛用于AB4的固相萃取。

t/mina AB4標(biāo)準(zhǔn)品

3 結(jié) 論

采用表面分子印跡方法，以低成本、綠色化學(xué)理念，制備出能識(shí)別糖苷類化合物的Rha-MMIPs，該聚合物具有較好的磁性和熱穩(wěn)定性，其對(duì)AB4具有較強(qiáng)的吸附親和力，能快速識(shí)別并磁控分離白頭翁中的AB4。此外，Rha-MMIPs具有良好的重現(xiàn)性。為研究糖苷類化合物提供了新的固相萃取劑，對(duì)于降低AB4標(biāo)品價(jià)格、加快AB4的檢測(cè)速度以及提高檢測(cè)的靈敏度具有非常重要的意義。