李長江，朱珊珊，王娜，聶夢嬌，鄭國棟，楊麗聰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與分離重點實驗室，江西 南昌，330045)

蘋果是世界四大水果之冠，汁甜肉脆，富含鐵、鉀、有機酸等營養(yǎng)成分，有清熱化痰，補中益氣的功效[1]。鮮切蘋果是指蘋果經(jīng)去皮、去核、切分、保鮮等工藝處理的輕加工產(chǎn)品，很大程度上保持了蘋果肉脆、多汁、味美的特征[2]。隨著生活方式的改變，鮮切蘋果等營養(yǎng)、健康、安全，方便的輕加工食品已經(jīng)形成并深受消費者喜愛，然而加工過程中的機械損傷加速了鮮切蘋果水分及營養(yǎng)物質(zhì)流失，同時促進酶促褐變、組織軟化、果片表面微生物生長，嚴重降低鮮切蘋果的營養(yǎng)價值和商品價值，極大地縮短了鮮切蘋果的貨架期[3-5]。目前，通過物理保藏方法，如低溫貯藏、食用涂膜、氣調(diào)保鮮、紫外輻照等方式處理鮮切蘋果，不同程度地延長了鮮切蘋果的貨架期，但這類方法對貯藏環(huán)境要求嚴苛，投入成本過高，技術(shù)要求復(fù)雜，難以控制[6-8]?；瘜W(xué)保鮮方法成本低廉、操作簡便、保鮮效果好，被人們廣泛接受。例如，抗壞血酸(Vc)等抗氧化劑是防止鮮切水果褐變，保持水果品質(zhì)的重要方法，但Vc性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，當Vc被完全氧化成脫氫抗壞血酸時就會喪失抑制褐變的能力，同時可能會引起鮮切蘋果的氧化損傷[9-10]。因此，開發(fā)穩(wěn)定、安全的抗氧化劑是目前果蔬保鮮的重要工作。

硒(selenium，Se)被譽為“生命元素”，是人體必須的微量營養(yǎng)元素及一些抗氧化酶(谷胱甘肽過氧化物酶、谷氨酸還原酶等)的重要組成成分[11]，有增強免疫、抗氧化、預(yù)防心血管疾病、拮抗重金屬毒性等功效[12-14]。因此富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)已然成為熱潮，但是硒的活性與毒性之間的作用范圍較窄，相比于無機硒和有機硒，納米硒(SeNPs)具有毒性小，生物利用度高，生物活性好的優(yōu)勢[15-16]。目前SeNPs主要用于藥物開發(fā)，在果蔬保鮮方面的研究鮮有報道。本試驗以Vc還原亞硒酸鈉制得Vc修飾納米硒(Vc modified nano selenium，Vc@SeNPs)，通過測定體外抗氧化指標及鮮切蘋果褐變，失重率、平均散失率和總酚含量，初步評價Vc@SeNPs對鮮切蘋果品質(zhì)的影響，以期獲得即可膳食補硒，又可保持鮮切蘋果品質(zhì)的果蔬保鮮劑，并為開發(fā)更加安全有效的果蔬保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果：選取大小均一，八至九成熟，無機械損傷和病蟲害，購買后保存于4 ℃冰箱。

Vc、30% H2O2、FeSO3、水楊酸、鄰苯三酚，均為分析純，天津永大化學(xué)試劑廠；亞硒酸鈉，鄭州紅祥化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、亞硒酸鈉、Na2CO3、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)[2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Titan透射電鏡，中國FEI公司；多功能酶標儀，Moecular Devices；UV-5200型UV-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜，美國Thermo公司；AUY120型電子天平,島津公司；CL-3型磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Vc@SeNPs的制備

依據(jù)軟模板法制備Vc@SeNPs并適當調(diào)整[17]。以PVP為模板劑，Vc為還原劑。將200 μL Vc溶液(0.2 mol/L)加入小燒杯中，并用磁力攪拌器輕輕攪拌，然后將100 μL亞硒酸鈉溶液(0.1 mol/L)和50 μL PVP(5.0 g/L)溶液滴入Vc溶液中，攪拌至顏色由無色變至磚紅色，將所得溶液離心，棄去上清液，將沉淀復(fù)溶后定容至10 mL，4 ℃保存。

1.2.2 Vc@SeNPs的化學(xué)表征

1.2.2.1 紫外-可見光譜(ultraviolet-visible absorption spectrometry, UV-Vis)測定

將Vc與Vc@SeNPs稀釋至適當濃度后，在190～450 nm波長范圍內(nèi)檢測紫外掃描吸收峰。

1.2.2.2 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)測定

FT-IR測定采用溴化鉀壓片法，取適量冷凍干燥的Vc@SeNPs粉末與溴化鉀按照1∶100質(zhì)量比混合，測定紅外吸收峰。

1.2.2.3 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)表征

取10 μL Vc@SeNPs滴至TEM專用銅網(wǎng)上，室溫放置至干燥，于FEI透射電子顯微鏡上觀察并拍照。

1.2.3 Vc@SeNPs體外抗氧化活性測定

1.2.3.1 還原力測定

參考OYZIAU[18]測定還原力的方法并適當調(diào)整。不同濃度的Vc@SeNPs溶液及Vc溶液1 mL,加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mmol/L，pH 6.6)、2.5 mL K3Fe(CN)6(10 g/L)溶液，50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸(100 g/L)溶液，終止反應(yīng)后3 000 r/min離心10 min, 取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3(1.0 g/L)，測定700 nm處混合物的吸光度。

(1)

式中：E，清除率，%；A0，空白吸光度；A1，樣品吸光度；A2，顯色劑本底吸光度。

1.2.3.3 羥自由基(·OH)清除能力測定

參照LI等[20]的方法測定·OH清除能力。取不同濃度的Vc@SeNPs溶液1 mL分別與FeSO4(9 nmol/L，1 mL)、水楊酸-乙酸溶液(9 nmol/L，1 mL)、H2O2溶液(9 nmol/L，1 mL)混勻，37 ℃水浴30 min，以超純水為空白， Vc為陽性對照，510 nm處測定吸光值，各組均為3個平行，取平均值，根據(jù)1.2.3.2中公式(1)計算清除率。

1.2.3.4 DPPH自由基清除能力測定

參照MA等[21]的方法稍作改動。取不同濃度的Vc@SeNPs溶液及DPPH-乙酸溶液各2 mL，搖勻，25 ℃避光放置30 min，在517 nm處測定吸光度，以無水乙醇替代樣品溶液為空白對照，以不同濃度Vc溶液作為陽性對照，各組均為3個平行，取平均值。根據(jù)1.2.3.2中公式(1)計算清除率。

1.2.4 Vc@SeNPs對鮮切水果的保鮮試驗

1.2.4.1 鮮切蘋果的處理

將置于4 ℃的蘋果在室溫(22 ～25 ℃)條件下放置2 h后清洗、去皮、去核、切塊(切為1cm左右厚度的蘋果片)，分別用蒸餾水、10、30、50 g/L Vc@SeNPs或Vc浸泡后，測定各個時間段的相關(guān)指標。

1.2.4.2 感官評價

參照管磬馨等[22]的方法。請10位具備食品感官評定專業(yè)知識的人員對蘋果切片的色澤、氣味、組織狀態(tài)等指標進行評分，評定標準如表1所示。

表1 鮮切蘋果感官評分細則

1.2.4.3 褐變度測定

稱取2 g鮮切蘋果，分別放入30 mL 10、30、50 g/L Vc或Vc@SeNPs溶液及蒸餾水中浸泡，觀察不同時間段內(nèi)鮮切蘋果的褐變情況，并拍照。

1.2.4.4 失重率和平均散失率測定

將鮮切蘋果分別放入裝有30 mL 10、30、50 g/L Vc或Vc@SeNPs溶液及蒸餾水中，浸泡30 min后用濾紙吸干其表面附著的水分，室溫(25 ℃)置于保鮮膜上，每隔30 min稱重并記錄數(shù)值。按公式(2)計算失重率，按公式(3)計算平均散失速率:

(2)

(3)

1.2.4.5 總酚含量測定

參照韓菊等[23]的方法。稱取0.5 g鮮切蘋果放入研砵中，分別加入100 μL 10、30、50 g/L Vc@SeNPs溶液，研磨成漿后定容至10 mL容量瓶中，取250 μL的樣液于10 mL試管中，再加入1.25 mL福林酚試劑，搖勻，3 min后加入75 g/L的Na2CO3溶液1 mL,振蕩。靜置1 h后在765 nm處測定吸光值，以10、30、50 g/L Vc溶液為陽性對照，蒸餾水代替Vc@SeNPs做空白測定，以沒食子酸做標準品測定標準曲線。每組重復(fù)測量3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行分析，結(jié)果表示為均值±標準差(Mean±SD)，P<0.05表示顯著差異。運用Origin 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vc@SeNPs化學(xué)表征

2.1.1 紫外-可見光譜分析

Vc及Vc@SeNPs的UV-Vis光譜如圖1所示。在220 nm以下的遠紫外區(qū)，Vc及Vc@SeNPs均有最大吸收峰，Vc的最大吸收峰位于266 nm處，Vc@SeNPs的最大吸收峰位于256 nm處。最大吸收峰藍移10 nm。依據(jù)王娜等[24]以沒食子酸修飾納米硒的紫外光譜，楊志恒等[25]對納米TiO2/β-CDP復(fù)合物的紫外光譜，可以推測Vc還原亞硒酸鈉后Vc側(cè)鏈的羥基(—OH)與SeO結(jié)合形成Se—O共價鍵，從而影響—OH吸收峰，導(dǎo)致Vc@SeNPs特征峰藍移。

圖1 Vc@SeNPs的紫外-可見光譜

2.1.2 FT-IR光譜分析

Vc@SeNPs紅外光譜如圖2所示。

圖2 Vc@SeNPs紅外圖譜表征

Vc圖譜中3 410.65 cm-1為—OH伸縮振動，1 029.56 cm-1為—OH面內(nèi)彎曲振動峰[26]。對比Vc圖譜發(fā)現(xiàn)，Vc@SeNPs圖譜中的上述特征峰均發(fā)生移動，這是由于Vc側(cè)鏈中的—OH與SeO結(jié)合后形成Se—O共價鍵，分子間氫鍵作用增強，表明Vc與SeNPs結(jié)合形成Vc@SeNPs[27]。

2.1.3 TEM表征

Vc@SeNPs的形貌如圖3所示。Vc@SeNPs呈明顯單分散球狀顆粒，分散性良好，粒徑分布均勻。粒徑分布如圖4所示，通過Nano Measurer 1.2軟件分析得出Vc@SeNPs平均粒徑為64.80 nm。

圖3 Vc@SeNPs透射電鏡表征

圖4 Vc@SeNPs粒度分布柱狀圖(a)及分布曲線(b)

2.2 Vc@SeNPs體外抗氧化活性測定

2.2.1 Vc@SeNPs還原力活性評價

還原力被認為是評價抗氧化能力最重要的指標，直接反映了抗氧化劑清除自由基能力的強弱[18]。Vc@SeNPs的還原能力如圖5所示。

圖5 Vc@SeNPs對還原力的影響

在一定濃度范圍內(nèi)，Vc@SeNPs的還原能力隨濃度的增大而增加，呈濃度依賴性。當樣品質(zhì)量濃度為0.1 g/L時，Vc@SeNPs的還原力是Vc的1.65倍，表明在低濃度時Vc@SeNPs還原力較強，當質(zhì)量濃度升高至0.6 g/L時，Vc@SeNPs還原力為1.87，仍高于相同濃度下Vc的還原力，表明Vc@SeNPs具有較強的還原能力。

2.2.2 Vc@SeNPs清除·OH活性評價

·OH被認為是最活潑的氧化劑，可以與細胞中的蛋白質(zhì)、核酸以及糖類等各種大分子物質(zhì)作用導(dǎo)致細胞損傷[28]。Vc具有較強的還原能力，可以與·OH發(fā)生氧化還原反應(yīng)以降低自由基對機體的危害[29]。Vc@SeNPs對·OH的清除能力如圖6所示。在0.1～0.6 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Vc@SeNPs對·OH的清除能力與Vc相當，IC50為0.10 g/L，且有明顯的量效關(guān)系。當Vc@SeNPs質(zhì)量濃度為0.6 g/L時對·OH的清除率為77.9%，是Vc的90%。由此可見，Vc@SeNPs對·OH的清除能力較強。此外，鄭曉鳳[30]研究發(fā)現(xiàn)，當SeNPs及Vc質(zhì)量濃度為10 g/L時，SeNPs對·OH的清除能力與Vc相當，但在低濃度時Vc對·OH的清除能力高于SeNPs，與本文結(jié)果相似。

圖6 Vc@SeNPs對·OH的清除率

圖7 Vc@SeNPs對清除率的影響

2.2.4 Vc@SeNPs清除DPPH自由基活性評價

DPPH被廣泛用于評估各種抗氧化劑對自由基清除作用。在抗氧化劑存在的情況下，DPPH自由基可以接受電子或氫原子以減少自由基損傷[32]。如圖8所示，Vc@SeNPs對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增大而增加，具有明顯的量效關(guān)系，IC50為0.51 g/L。當質(zhì)量濃度為0.1 g/L時，Vc@SeNPs對DPPH清除率是Vc的62%，當質(zhì)量濃度增高至0.4 g/L時，Vc@SeNPs對DPPH的清除率是Vc的45%，表明Vc@SeNPs在0.1～0.6 g/L范圍內(nèi)均能有效清除DPPH自由基。

圖8 Vc@SeNPs對DPPH清除率的影響

2.3 Vc@SeNPs對鮮切蘋果保鮮效果的影響

2.3.1 Vc@SeNPs對鮮切蘋果感官品質(zhì)的影響

感官品質(zhì)是綜合評價鮮切蘋果品質(zhì)的重要指標。不同濃度Vc@SeNPs或Vc溶液對鮮切蘋果感官品質(zhì)影響如圖9所示，10、30、50 g/L Vc@SeNPs或Vc溶液處理后鮮切蘋果感官評分隨貯藏時間的延長而降低。10、30、50 g/L Vc@SeNPs溶液處理鮮切蘋果感官評分明顯優(yōu)于Vc溶液處理組及蒸餾水處理組。處理2 h內(nèi)，Vc@SeNPs及Vc處理組狀態(tài)良好，未表現(xiàn)出色澤變黃，有不良氣味等癥狀。處理4 h以后，Vc處理組均出現(xiàn)色澤變黃，有些部位出現(xiàn)棕褐色，蘋果香味變淡，而10、30、50 g/L Vc@SeNPs處理組感官評分均大于60分，且未出現(xiàn)褐變，氣味變淡等不良狀態(tài)。6 h以后蒸餾水處理組蘋果切面出現(xiàn)嚴重褐變，切面表層發(fā)黏，幾乎無蘋果香味。而Vc@SeNPs處理組感官評分雖有所下降，但組織狀態(tài)，蘋果香味以及色澤等均表現(xiàn)良好。綜合比較發(fā)現(xiàn)， 30、50 g/L Vc@SeNPs處理均可較好的保持鮮切蘋果的新鮮度，延長鮮切蘋果的貨架期，其中50 g/L Vc@SeNPs處理組效果最佳。

圖9 不同處理對鮮切蘋果感官品質(zhì)的影響

2.3.2 Vc@SeNPs對鮮切蘋果褐變的影響

色澤是消費者評估鮮切果蔬外觀品質(zhì)的重要指標，也從一定程度上反映了鮮切果蔬的營養(yǎng)價值變化。蒸餾水處理后，蘋果褐變程度隨儲藏時間的延長而加劇。這可能是由于機械切割破壞蘋果組織結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，過量的活性氧加劇膜脂質(zhì)過氧化，膜滲透性增大，進而加劇酶促褐變[33-34]。對比蒸餾水，30、50 g/L Vc@SeNPs及Vc均可顯著抑制鮮切蘋果褐變，但兩者并無明顯差異，而10 g/L Vc@SeNPs及10 g/L Vc對防止鮮切蘋果褐變的效果差異較大。如圖10所示，處理6 h后，10 g/L Vc@SeNPs處理組鮮切蘋果僅有輕微褐變，10 g/L Vc處理組鮮切蘋果褐變程度加深，顯著優(yōu)于蒸餾水處理組。表明Vc@SeNPs能有效延緩鮮切蘋果發(fā)生褐變。

圖10 處理6 h時鮮切蘋果的褐變情況

由于Vc@SeNPs具有較好的自由基清除效果，因此，Vc@SeNPs可能通過自身抗氧化特性清除機械損傷中產(chǎn)生的大量自由基，從而延緩蘋果切片褐變。

2.3.3 Vc@SeNPs對鮮切蘋果失重率的影響

水分是影響鮮切水果品質(zhì)的重要因素，直接反映了鮮切蘋果的新鮮狀況[35]。鮮切蘋果在加工過程中細胞受損，呼吸強度增大，蒸騰作用加劇，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)流失，果品品質(zhì)下降，貨架期縮短[36]。由圖11可知，鮮切蘋果在貯藏期間質(zhì)量變化較大，說明貯藏期間鮮切蘋果呼吸強度較高，水分散失較多。對比不同處理組發(fā)現(xiàn)，蒸餾水處理組失重率增長最快，Vc及Vc@SeNPs處理組均能有效減緩鮮切蘋果水分散失，其中50 g/L Vc@SeNPs處理組對鮮切蘋果的水分維持明顯優(yōu)于蒸餾水及50 g/L Vc處理組(P<0.05)。這是由于Vc@SeNPs有效降低了鮮切蘋果面水膜的透過率，阻斷了水蒸氣散失[37]。表明Vc@SeNPs可以減緩蘋果質(zhì)量的下降速度，較好地保持蘋果的水分。

圖11 不同處理對鮮切蘋果失重率的影響

2.3.4 Vc@SeNPs對鮮切蘋果水分平均散失率影響

鮮切蘋果的水分平均散失率如圖12所示，所有處理組均在貯藏前1 h內(nèi)急劇升高，1～3 h內(nèi)各組平均散失率均有所延緩，之后平緩下降。這表明蘋果切片在貯藏前3 h內(nèi)水分散失較快，應(yīng)在此階段做好保鮮措施。

圖12 不同處理對鮮切蘋果水分平均散失率的影響

對比不同處理組發(fā)現(xiàn)，不同濃度Vc處理組平均散失率存在差異，其中，50 g/L Vc處理組優(yōu)于10 g/L Vc處理，這與楊巍等[38]的研究一致。對比不同濃度Vc和Vc@SeNPs處理組發(fā)現(xiàn)，Vc@SeNPs處理明顯優(yōu)于蒸餾水和Vc處理組，其中50 g/L Vc@SeNPs處理水分平均散失率最低，是50 g/L Vc處理的58%(P<0.05)。這表明50 g/L Vc@SeNPs處理鮮切蘋果能有效防止水分散失。

2.3.5 Vc@SeNPs對鮮切蘋果總酚含量的影響

蘋果多酚是蘋果生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是蘋果及其加工產(chǎn)品重要的呈味物質(zhì)及顯色物質(zhì)。如圖13所示，貯藏期間不同處理鮮切蘋果總酚含量均呈下降趨勢。貯藏0 h，鮮切蘋果總酚含量為1 410 mg/kg，貯藏7 h，鮮切蘋果總酚含量為634.65～1 134.00 mg/kg，與LI等[4]和CHEN等[37]研究一致。對比不同濃度Vc及Vc@SeNPs處理組發(fā)現(xiàn)，不同處理組存在差異，10、30、50 g/L Vc@SeNPs處理組總酚含量均高于Vc及蒸餾水處理組，其中50 g/L Vc@SeNPs處理組總酚含量僅下降19.5%，是蒸餾水處理組的1.79倍， 是50 g/L Vc處理組的1.42倍，這可能是由于Vc及Vc@SeNPs均屬于抗氧化性物質(zhì)，當Vc及Vc@SeNPs含量較高時不僅抑制了鮮切蘋果多酚氧化，而且促進酚類物質(zhì)生成，因而Vc@SeNPs可有效延緩鮮切蘋果多酚氧化[38]。

圖13 不同處理對鮮切蘋果總酚含量的影響

3 結(jié)論