崔文玉，許新月，張仁堂，弓志青，王文亮*，王延圣*

1(山東省農業(yè)科學院農產品研究所，山東省農產品精深加工技術重點實驗室，農業(yè)部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南，250100) 2(山東農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271000)

香蕉在低溫貯藏過程中，容易受低溫脅迫的影響[1]。緩解香蕉冷害并延長保質期、提高香蕉冷藏品質的處理方法成為研究熱點。香蕉在低溫貯藏過程中色澤會變暗甚至失去光澤，并且在貯藏過程中硬度逐漸下降、感官品質降低[2]。此外，香蕉在低溫貯藏過程中代謝組織中會產生活性氧離子(reactive oxygen species, ROS)，而抗氧化系統(tǒng)能夠清除活性氧離子，保持其含量處于較低水平。低含量的活性氧離子具有傳遞信號、加速代謝等作用，而高濃度的活性氧離子則會通過氧化作用對植物組織造成損傷，加速腐敗進程，因此，維持較低水平活性氧含量對抑制果蔬衰老具有積極的作用[3-4]。H2S和NO作為信號分子，在果蔬采后代謝調控中發(fā)揮著重要的作用，早在20世紀中期研究人員發(fā)現(xiàn)大豆、黃瓜、棉花等植物體可以釋放H2S[5]。隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)H2S和NO參與調節(jié)植物的一系列生理學反應，包括植物的生長發(fā)育、氣孔運動、衰老等[6-10]。

近年來有研究表明，H2S和NO的交互作用對植物的生理過程具有調節(jié)作用，H2S和NO都對植物生理過程具有雙重作用，即在高濃度時具有細胞毒性，而在低濃度時作為細胞信號分子發(fā)揮作用，并且存在多種途徑對H2S的代謝平衡進行調節(jié)[11]。WANG等[12]發(fā)現(xiàn)外源H2S促進內源NO的積累[15]，從而增強苜蓿的耐鹽性，而NO清除劑c-PTIO可以抑制H2S的這種誘導作用，表明H2S可能是通過調控NO的代謝來進行脅迫響應。H2S對于NO代謝機制的影響尚未定論，H2S不管是促進還是抑制細胞中NO的積累都有相關報導[13-14]。通過外源H2S處理可以促進NO的累積從而緩解苜蓿遭受鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)H2S可以促進NO的積累[15]，由此推測H2S是否在緩解低溫對香蕉的脅迫方面也有相同的機制。本實驗以巴西蕉為實驗材料，研究H2S與NO的交互作用及c-PTIO對低溫貯藏的香蕉果實品質、抗氧化水平的影響，旨在為H2S與NO交互作用對香蕉低溫貯藏保鮮影響的研究提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

選用巴西香蕉，成熟度在7～8成，挑選果型端正無褐斑和機械傷、大小均勻的果實作為試驗材料。

1.1.2 主要儀器設備

CR22D111高速冷凍離心機，日本日立公司；AR423CN電子分析天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司產品；UV-6100紫外可見分光光度計,上海元儀儀器有限公司；IN612C恒溫試驗箱，日本雅馬拓公司；雷磁DDB-303A電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；CR-400色差儀，日本島津公司；HH-S6數(shù)顯恒溫浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；TA.XT Plus食品質構儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理方法

利用不同濃度的硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP)(0.1、0.5、1、2、5、8 mmol/L)和NaHS(0.5、1、1.5、2、3、8 mmol/L)進行香蕉低溫貯藏預實驗，根據(jù)預實驗的結果，選取保鮮效果較好的2 mmol/L SNP、1 mmol/L NaHS，以及0.03 mmol/L NO抑制劑(c-PTIO)溶液分別裝入不同的真空干燥器中。在氣壓為0.05 MPa條件下，抽真空處理香蕉果實5 min,設定蒸餾水抽真空5 min為對照組，每組6根香蕉果實。將4組經過抽真空處理后的香蕉放入0.04 mm厚度的聚乙烯薄膜袋內進行7 ℃低溫貯藏15 d。

1.2.2 低溫貯藏溫度及時間

香蕉果實處理后置于7 ℃恒溫箱中貯藏。在第0、3、6、9、12、15天分別從每個處理組的6根香蕉中隨機取4根，選取香蕉赤道部位測定其果皮的各項指標。將取出的香蕉皮切成小塊放入液氮中冷凍并置于-80 ℃冰箱中貯藏備測。

1.2.3 NO含量的測定

參照ZHANG等[10]的方法加以改動，NO在酸性條件下的代謝產物為磷酸鹽和亞硝酸鹽，通過格里斯試劑對這些穩(wěn)定離子的量進行測定，可以間接計算得出NO的含量。取冷凍香蕉果皮2.0 g,加入5 mL pH 7.50 Na3PO4緩沖液(含1 mmol/L二流蘇糖醇,1 mol/L MgCl2)，冰浴研磨，于4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液用于NO含量的測定。

1.2.4 品質指標的測定

冷害指數(shù)的測定參照PONGPRASERT等[16]的方法。

硬度的測定參照LISJAK等[13]的方法。

色澤的測定參照EUM等[17]的方法。

1.2.5 相對電導率的測定和丙二醛的測定

相對電導率的測定采用陳發(fā)河等[18]的方法。

丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的測定采用范蓓等[19]的方法。

H2O2含量的測定采用王倩[21]的方法。

1.2.7 各種抗氧酶活性的測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定參照FU等[23]的方法并加以改動，測定采用南京建成總超氧化物歧化酶試劑盒。

抗壞血酸過氧化物酶(aseorbateperoxidase, APX)活性測定參照PONGPRASERT等[16]的方法并加以改動，活性測定時反應體系包括：0.1 mL酶提取液，0.1 mL 5 mmol/L抗壞血酸鈉溶液， 1.7 mL 50 mmol/L Na3PO4緩沖液，0.1 mL 20 mmol/L H2O2(最后加入反應體系以啟動反應)。

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammo-nialyase, PAL)活性測定參照YINGSANGA等[24]的方法并加以改動，活性測定時反應體系包括：2 mL pH 7.8硼酸緩沖液，1.0 mL 20 mmol/L的苯丙氨酸緩沖液，0.2 mL的酶提取液。

過氧化氫酶(catalase, CAT)活性測定參考劉琦琦等[25]方法并加以改動，活性測定時反應體系包括：8 mL pH 7.0,濃度為 50 mmol/L Na3PO4緩沖液，0.1 mL酶提取液，0.2 mL 40 mmol/L 的H2O2(最后加入反應體系)。

過氧化物酶(peroxidase, POD)活性測定參考劉暢等[26]方法并加以改動，活性測定時反應體系包括：2 mL pH 7.0, 濃度為 50 mmol/L Na3PO4緩沖液(含40 mmol/L凍結愈創(chuàng)木酚),150 μL的提取液和0.08%的H2O2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各指標測定均重復3次，采用SPSS 10.0軟件進行顯著性分析，P<0.01表示差異極顯著，用Origin軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，P表示最小顯著性差異(least-significant difference, LSD)在0.05水平的數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對NO含量的影響

由圖1可看出，香蕉果皮的NO含量在低溫貯藏期間大體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其中經NO處理的香蕉果皮的NO含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且始終高于對照組NO含量的水平。在低溫貯藏第3天時，經NO處理的香蕉果皮的NO含量達到最高值，為同期c-PTIO處理組香蕉果皮NO含量的2.23倍。

圖1 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮NO濃度的影響

2.2 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對香蕉果皮冷害指數(shù)的影響

香蕉冷害現(xiàn)象的直接表現(xiàn)為果實表面出現(xiàn)凹陷、變黑甚至腐爛，冷害指數(shù)是評價冷害程度的指標。從圖2得出，低溫貯藏至9 d時，經NO和H2S處理的香蕉冷害指數(shù)要小于對照組，而c-PTIO處理的香蕉則會產生相反的效果，冷害指數(shù)明顯大于對照組。在低溫貯藏第9天時，經NO處理的香蕉冷害指數(shù)僅為對照組的1/3。

圖2 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮冷害指數(shù)的影響

2.3 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對香蕉果皮低溫貯藏期間硬度的影響

軟化是果實成熟、衰老的重要標志。從圖3可以看出，香蕉果皮硬度整體變化趨勢為先上升后下降。其中對照組的果皮硬度在貯藏過程中波動較大。在低溫貯藏第9天時，經NO處理的香蕉果皮硬度明顯高于對照組，其差值為8.62%，而其他處理組的果皮硬度則要略低于對照組。

圖3 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮硬度的影響

在低溫貯藏第15天時，經NO處理的香蕉果皮硬度明顯高于對照組，而經c-PTIO處理的香蕉果皮硬度則僅為對照組的76.90%，比硬度最高的處理組低36.30%。

2.4 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對低溫貯藏期間香蕉果皮色澤的影響

香蕉在7～8成熟采收后顏色呈現(xiàn)綠色，隨著貯藏時間的延長，香蕉逐漸變?yōu)辄S色。但遭受冷害的香蕉不能正常后熟，香蕉表皮會變發(fā)生褐變，因此香蕉表觀顏色是評價香蕉受冷害程度的重要指標。從表1可以看出，香蕉的亮度與色度角在低溫貯藏過程中均成下降趨勢，其中對照組的色度角在前期下降速度較快,而后期下降速度逐漸減慢。經c-PTIO處理的香蕉色度角在各個階段均低于對照組，在6～15 d差異尤為明顯，在第12天時，經c-PTIO處理的香蕉色度角比對照組低12.84%。

表1 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮色澤的影響

2.5 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對低溫貯藏期間香蕉果皮相對電導率和MDA含量的影響

植物在遭受寒冷脅迫時，自身活性氧會大量積累，從而誘發(fā)膜脂的過氧化作用。MDA是膜脂過氧化重要的產物之一，與相對電導率同為反應膜系統(tǒng)受損程度以及植物抗逆性的重要指標[27]，如圖4所示。

圖4 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮MDA含量和相對電導率的影響

在6～15 d時，經c-PTIO處理的香蕉中MDA含量上升幅度要明顯大于其他處理組及對照組。在第9天時，經c-PTIO處理的香蕉MDA含量比對照組高42.86%；并且相對電導率與對照組電導率的差異達到最大，為40.02%。隨著貯藏時間的延長，差異逐漸減小，在第15天時，c-PTIO處理組比對照組低25.95%。

2.6 H2S、NO、H2O、c-PTIO處理對低溫貯藏期間香蕉果皮H2O2含量和產生速率的影響

圖5 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮H2O2含量和生成速率的影響

2.7 H2O、NO、H2S、c-PTIO處理對抗氧酶系統(tǒng)的影響

抗氧化系統(tǒng)在植物清除自由基中發(fā)揮著重要的作用，這個系統(tǒng)包括2大類，一類是由酚類物質，抗壞血酸(asobic acid, ASA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)等非酶抗氧化物質組成，另一類是APX、SOD、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、POD等抗氧化酶，其中ASA-GSH循環(huán)系統(tǒng)在冷害防御體系中扮演著重要的角色[28]。

2.7.1 香蕉果皮SOD、POD及CAT酶活性的變化

從圖6可以看出，SOD活性在低溫貯藏過程中整體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其中經c-PTIO處理的香蕉的SOD酶活性下降速度要明顯快于其他處理組，與對照組下降速度相當。其中經H2S，NO處理的香蕉酶活性要明顯高于對照組，其中H2S處理組最高，在第15天時，與對照組差異達到50.10%。在整個貯藏過程中，除經c-PTIO處理的香蕉外，其他處理組CAT酶活性均高于對照組。經NO處理的香蕉CAT酶活力為所有處理組中最高的，且在第9天時與對照組活性差異達到最大，較對照組高28.30%，為c-PTIO處理組活性的1.79倍。在3～12 d的貯藏過程中，H2S及NO處理組的POD酶活性都高于對照組及c-PTIO處理組。

2.7.2 香蕉果皮APX和PAL活性的變化

從圖7可知，APX酶活性在低溫貯藏過程中均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。其中經H2S和NO處理的香蕉APX酶活性的上升幅度要明顯大于其他處理組及對照組，且在第12天時與其他處理組及對照組的活性差異達到最大，H2S處理組酶活性比對照組高23.33%，NO處理組酶活性比對照組高26.28%。在0～12 d內c-PTIO處理組的PAL酶活性要明顯低于其他處理組，且在第3天時，差值達到最大，經H2S處理的香蕉果實的PAL酶活性達到了對照組的1.6倍，是c-PTIO處理組的1.7倍，差異隨貯藏時間延長逐漸縮小。

圖7 外源NO、H2S、c-PTIO和H2O處理對香蕉果皮APX和PAL活性的影響

3 結論與討論

H2S和NO的交互作用可以延緩在冷藏期間香蕉果實硬度下降、保持較好的光澤度，而c-PTIO處理則呈現(xiàn)相反的效果。類似的結論也見于葡萄研究中，使用外源H2S及NO對低溫貯藏下的果實進行處理，可以通過抑制其活性氧產物的積累，從而提高其抗氧化酶系統(tǒng)的活性，來減輕果實遭受冷害的程度[29]。在低溫貯藏過程中香蕉顏色逐漸變暗、失去光澤度，通過H2S和NO處理可以減緩葉綠素的降解來保持采后果皮的光澤度和鮮亮的顏色,減少葉綠體脂質和蛋白質氧化的程度，此外還可以作用于葉綠體進而影響和調控一系列下游信號分子，該結果與前期研究結果相類似[30]。香蕉果皮的相對電導率在整個低溫貯藏過程中的變化趨勢與MDA含量大致相同，整體呈現(xiàn)上升趨勢,這與HU等[31]和陳發(fā)河等[18]研究的結果相類似。

APX作為輔助抗氧化酶，其含量呈逐漸上升的趨勢；PAL作為酚類合成過程中至關重要的酶之一，其含量呈先上升后逐漸下降的趨勢。這可能是由于各種代謝加劇，活性氧含量增加，引發(fā)了抗氧化系統(tǒng)[30,37-38]。最近，有研究表明H2S處理可以降低脂氧合酶的活性(lipoxygenase, LOX)，通過減少活性氧含量，進而可以維持抗壞血酸和谷胱甘肽處于一個較高的水平，同時增加APX、GR活性，進一步緩解許多植物的非生理脅迫[39-40]。在低溫條件下，經NO和H2S處理后的果蔬PAL含量的增加可能與其自身的防御機制有關，同時也促進了多酚類物質的積累[41]。在番茄幼苗的研究中，NO和H2S處理可以通過提高其抗氧化酶活性來緩解鹽脅迫和干旱脅迫對植物組織帶來的傷害[42-43]。由此推斷NO和H2S的交互作用來緩解低溫脅迫對香蕉組織產生的影響。