黃笑非，屈彤彤，丁洋，雷彤彤，張潔，唐選明*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100193) 2(北京物資學(xué)院，物流學(xué)院/北京市物流系統(tǒng)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，101149)

果蔬品質(zhì)在采后貯藏過(guò)程中逐漸下降，因此常選擇低溫來(lái)延長(zhǎng)果蔬貯藏壽命，維持果蔬的品質(zhì)質(zhì)量[1]。溫度極大影響著采后果蔬的貯藏品質(zhì)[2]，若貯藏溫度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致諸如番茄、黃瓜等冷敏型果蔬發(fā)生冷害[3]。冷害是指貯藏溫度降到果蔬自身所能忍受的極限以下時(shí)所受到的傷害[4]，冷害癥狀往往不會(huì)在貯藏過(guò)程中出現(xiàn)，而是將果蔬轉(zhuǎn)移到常溫下才會(huì)表現(xiàn)出來(lái)。番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界上最重要也是應(yīng)用最廣泛的果蔬之一，常作為研究冷害的模型植物[5]。番茄的冷害癥狀主要有果皮褐變、表面出現(xiàn)凹陷、水漬狀斑點(diǎn)、干疤、腐爛加快等[6-7]，造成果實(shí)嚴(yán)重腐爛和品質(zhì)劣變，縮短了果實(shí)貨架期，限制了低溫技術(shù)在番茄等冷敏性果蔬貯藏中的應(yīng)用。

赤霉素(gibberellins，GAs)作為一種重要的植物內(nèi)源性激素，在促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、促進(jìn)植物器官生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗冷性等方面都發(fā)揮著十分重要的作用[8-10]。司敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)發(fā)育期的李果實(shí)進(jìn)行100 mg/L赤霉素處理，能夠有效控制李果實(shí)的冷害癥狀；ZHU等[12]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L赤霉素處理能有效保持番茄果實(shí)膜的穩(wěn)定性，維持細(xì)胞壁完整性，降低低溫貯藏條件下番茄果實(shí)中抗氧化酶的活性，從而提高采后番茄果實(shí)的抗冷能力。在活性赤霉素的生物合成途徑中，貝殼杉烯合酶是合成前期階段的重要因素，赤霉素缺失型突變株gib-3正是由于該酶活性喪失，無(wú)法合成貝殼杉烯[13]；貝殼杉烯作為GA合成的前體物質(zhì)，它的缺失造成植株內(nèi)赤霉素合成受阻，從而導(dǎo)致植株內(nèi)赤霉素缺失，產(chǎn)生植物矮化、節(jié)間短、果實(shí)小等不良癥狀[14]。目前對(duì)于赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)抗冷性影響的研究較少，關(guān)于赤霉素增強(qiáng)采后番茄果實(shí)抗冷性綜合機(jī)制的建立仍不全面。本研究采取綠熟期的野生型番茄果實(shí)和赤霉素缺失型番茄果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，統(tǒng)計(jì)番茄果實(shí)的冷害指數(shù)，觀察番茄果實(shí)的超微結(jié)構(gòu)，從赤霉素缺失時(shí)細(xì)胞膜相關(guān)酶、細(xì)胞壁相關(guān)酶、抗氧化相關(guān)酶、抗逆相關(guān)酶方面入手，探究赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)抗冷性的影響，從而明確赤霉素在采后番茄果實(shí)抗冷調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型番茄果實(shí)及赤霉素缺失型突變體番茄果實(shí)，種子由C.M. Rick Tomato Genetics Resource Center提供，種植并采摘于北京市昌平區(qū)金六環(huán)農(nóng)業(yè)生態(tài)園，挑選符合實(shí)驗(yàn)要求的番茄果實(shí)進(jìn)行研究。

環(huán)氧樹脂、十二烯基琥珀酸酐(dodeceny succinicanhydride, DDSA)(優(yōu)級(jí)品)，北京金銳林科技發(fā)展有限公司；戊二醛(98%)，湖北新景新材料有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinyulpyrrolidone, PVPP)(化學(xué)純)、核黃素(化學(xué)純)，美國(guó)Sigma公司；氮藍(lán)四唑(分析純)，美國(guó)Amresco公司；NaClO、H3PO4、乙醇、丙酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、乙酸、乙酸鈉、多聚半乳糖醛酸、3,5-二硝基水楊酸、乙二胺四乙酸、K3PO4、甲硫氨酸、H2O2均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物果膠甲酯酶檢測(cè)試劑盒，北京凱美特科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

ZHWY-200H溫型無(wú)級(jí)調(diào)幅振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；QM100(S)型高通量研磨儀，五洲鼎創(chuàng)(北京)科技有限公司；TGL-16k型湖南湘儀臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器有限責(zé)任公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPARK型TECAN多功能酶標(biāo)儀，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；YP502N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；MX-S型旋渦混勻器，上海京工實(shí)業(yè)有限公司；日立H-7500型透射電子顯微鏡，株式會(huì)社日立制作所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料處理

將挑選好的大小、成熟度一致、無(wú)機(jī)械傷的野生型番茄果實(shí)(wild type, WT)和突變株番茄果實(shí)(gib-3)分別用水洗凈，用體積分?jǐn)?shù)為1%的NaClO溶液浸泡消毒2 min，再以自來(lái)水沖洗并瀝干表面。將所有番茄果實(shí)于4 ℃下貯藏28 d，濕度控制在80%～90%。于貯藏第14、21、28天取樣，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后測(cè)量其冷害指數(shù)；于貯藏第21天取樣，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后觀察其超微結(jié)構(gòu)；再于貯藏第0、3、7、14、21、28天對(duì)番茄果實(shí)的果皮進(jìn)行取樣，分別測(cè)量番茄果實(shí)的離子滲透率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、磷脂酶D(phospholipase, PLD)、脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase， PAL)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase, GST)的活性變化。每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行操作。

1.3.2 冷害指數(shù)測(cè)量

參考ZHAO等[15]的方法，略有改動(dòng)。4 ℃下貯藏第14、21、28 天時(shí)，對(duì)gib-3和WT型番茄果實(shí)取樣，每組取樣20個(gè)，轉(zhuǎn)移至室溫下，3 d后統(tǒng)計(jì)冷害指數(shù)。

1.3.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

4 ℃下貯藏21 d時(shí)，對(duì)gib-3和WT型番茄果實(shí)取樣，每組取樣6個(gè)，轉(zhuǎn)移至室溫下3 d后制作透射電鏡樣片，觀察其超微結(jié)構(gòu)。電鏡樣片的制作和觀察均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院加工研究所電鏡室進(jìn)行。用刀片將番茄果皮組織切成1 mm3的小塊， 用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛溶液(pH 7.2)固定2～4 h， 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4) 清洗2 h，再用10 g/L四氧化鋨固定，不同濃度梯度的酒精脫水，無(wú)水丙酮置換，35 ℃下用丙酮以2∶1體積比混合液滲透2 h，環(huán)氧樹脂包埋，500～1 000 üA 超薄切片，醋酸雙氧鈾-鉛雙染，在透射電子顯微鏡下觀察表皮下層細(xì)胞的變化并拍照。

1.3.4 離子滲透率測(cè)定

參考ZHANG等[16]的方法，略有改動(dòng)。用直徑6 cm的打孔器將番茄果實(shí)的果皮組織打成圓片，用蒸餾水洗滌后每6片轉(zhuǎn)移至盛有40 mL去離子水的錐形瓶中，測(cè)量電導(dǎo)率P0；室溫下?lián)u床振蕩2 h，測(cè)量電導(dǎo)率P1；置于沸水中煮沸10 min，立即冷卻至室溫，補(bǔ)充蒸發(fā)所散失的水分，測(cè)量電導(dǎo)率P2。離子滲透率(EI)按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.5 MDA含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法[17]測(cè)量番茄果實(shí)MDA含量，略有改動(dòng)。分別取gib-3和WT型番茄果實(shí)的果皮組織，在液氮中研磨成粉末，取1.5 g番茄果皮組織粉末，加入7 mL的100 g/L三氯乙酸溶液提取，均質(zhì)后于4 ℃下8 000×g離心10 min，取2 mL上清液(WT型番茄果實(shí)組中加入2 mL三氯乙酸溶液)，向其中加入2 mL TBA溶液(6.7 g/L)并混勻，在95 ℃下水浴20 min，冷卻至室溫，于4 ℃下8 000×g離心10 min，取上清液分別測(cè)定450、532和600 nm下的吸光值。MDA含量以鮮重表示，按公式(2)、(3)計(jì)算：

cMDA/(μmol·L-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

(3)

式中：cMDA，MDA濃度，μmol/L；V，三氯乙酸(提取用)體積，mL；V1，反應(yīng)體系體積，mL；V2，三氯乙酸(測(cè)定用)提取液體積，mL；m，樣品鮮重，g。

1.3.6 PLD、LOX活性測(cè)定

參考MAO等[18]的方法，對(duì)PLD、LOX活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 PG、PME活性測(cè)定

PG活性的測(cè)定方法參考GAYATHRI等[19]的方法，PME活性使用植物果膠甲酯酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.3.8 SOD、CAT活性測(cè)定

SOD和CAT活性均參考DING等[20]的方法測(cè)定。

1.3.9 PAL、GST活性測(cè)定

PAL和GST活性分別采用苯丙氨酸解氨酶活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)至少進(jìn)行3次平行操作，試驗(yàn)結(jié)果以平均值表示。使用SPSS 24軟件中的最小顯著性差異法和鄧肯分析對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)冷害指數(shù)的影響

番茄果實(shí)在4 ℃下貯藏14、21、28 d，轉(zhuǎn)移到室溫3 d后開始出現(xiàn)冷害癥狀。如圖1-a所示，與WT型番茄果實(shí)相比，gib-3型番茄果實(shí)表面凹陷程度、干疤、果肉褐變程度更為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)了微生物侵染現(xiàn)象，且觸感比WT軟爛。如圖1-b所示，4 ℃下貯藏的番茄果實(shí)冷害指數(shù)呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)，且gib-3型番茄果實(shí)的冷害指數(shù)顯著高于WT(P<0.05)。此外，貯藏第14、21、28天時(shí)，gib-3型番茄果實(shí)的冷害指數(shù)分別是WT的1.25、1.12、1.24倍。這表明，低溫貯藏下，赤霉素缺失加重了番茄果實(shí)的冷害癥狀，不利于番茄果實(shí)低溫下的長(zhǎng)期貯藏。

圖1 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)冷害癥狀(a)和冷害指數(shù)(b)的影響

2.2 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)超微結(jié)構(gòu)的影響

由于在4 ℃下貯藏21 d時(shí)，gib-3型番茄果實(shí)和WT的冷害指數(shù)差異最為顯著(P<0.05)，因此選取4 ℃下貯藏21 d的番茄果實(shí)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。通過(guò)對(duì)番茄果實(shí)的果皮組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察(圖2)，可以明顯看到，與WT相比，gib-3型番茄果實(shí)細(xì)胞壁破損現(xiàn)象更為嚴(yán)重，且細(xì)胞內(nèi)容物破碎，甚至泄漏至細(xì)胞外。另外，gib-3型番茄果實(shí)細(xì)胞壁較薄，且厚度不均勻，這可能是導(dǎo)致番茄果實(shí)果皮出現(xiàn)凹陷和果實(shí)軟爛的微觀原因[21]。在gib-3型番茄果實(shí)果皮細(xì)胞中，有較為明顯的退化的細(xì)胞器沉淀，可以清楚地觀察到質(zhì)壁分離等現(xiàn)象。這些微觀結(jié)構(gòu)變化增大了細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的接觸面積，加速了番茄果實(shí)的衰老和變質(zhì)，為病原菌的入侵提供了非常便利的條件[22]。由此可知，赤霉素缺失型番茄果實(shí)無(wú)法較好地保持低溫貯藏下果實(shí)細(xì)胞壁的完整性，加深了果實(shí)遭受冷害的程度。

圖2 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)MDA含量和離子滲透率的影響

MDA含量和離子滲透率的大小表明了低溫貯藏下番茄果實(shí)細(xì)胞膜的損傷程度和完整性[15]。MDA是膜脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，MDA含量的增加表明細(xì)胞膜完整性受到損害，常作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志[23]。如圖3-a所示，在整個(gè)貯藏期間，番茄果實(shí)的MDA含量逐漸升高，且gib-3型番茄果實(shí)的MDA含量顯著高于WT型番茄果實(shí)(P<0.05)；在貯藏第28天，gib-3番茄果實(shí)的MDA含量比WT高32.4%。這說(shuō)明赤霉素缺失加速了膜脂的過(guò)氧化進(jìn)程，無(wú)法避免番茄果實(shí)細(xì)胞膜遭受氧化損傷，無(wú)法維持細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而降低了其抗冷性。

離子滲透率常用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞膜透性損失，因此可以作為衡量細(xì)胞膜完整性的指標(biāo)[24]。由圖3-b看出，在整個(gè)貯藏周期，番茄果實(shí)的離子滲透率呈逐漸上升的趨勢(shì)，且gib-3型番茄果實(shí)的離子滲透率顯著高于WT(P<0.05)。貯藏第28天時(shí)，兩者離子滲透率相差最大，達(dá)到24.67%。這表明赤霉素缺失提高了番茄果實(shí)的離子滲透率，增大了細(xì)胞膜透性。

圖3 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)MDA含量(a)和離子滲透率(b)的影響

2.4 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)細(xì)胞膜相關(guān)酶活性的影響

前人研究表明[18,24]，PLD和LOX等與磷脂代謝有關(guān)的酶活性增加會(huì)加快膜磷脂的氧化反應(yīng)，增加脂質(zhì)不飽和度，增大細(xì)胞膜的流動(dòng)性，破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜降解，逐漸失去穩(wěn)態(tài)。由圖4-a所示，gib-3型番茄果實(shí)的PLD活性顯著高于WT(P<0.05)，且活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。貯藏第14天時(shí)2種類型的番茄果實(shí)PLD活性迅速升高，可能是因?yàn)榧?xì)胞中液泡破裂導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)變?yōu)樗嵝?，激活了PLD[24]。14 d之后，2種番茄果實(shí)的PLD活性逐漸下降，MAO等研究發(fā)現(xiàn)[18]，磷脂降解引起的膜硬化可能是貯藏后期番茄果實(shí)PLD活性降低的原因。

如圖4-b所示，低溫貯藏條件下，gib-3番茄果實(shí)的LOX活性顯著高于WT(P<0.05)，且2種番茄果實(shí)的LOX活性均呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。貯藏21 d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)WT的LOX活性為4 454.78 U/g，gib-3的LOX活性為6 486.37 U/g，比WT高45.6%；此后活性逐漸下降。貯藏后期LOX活性逐漸降低可能是由于膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的增加，使膜磷脂不飽和度升高，導(dǎo)致LOX的底物減少[18]。研究表明，PLD和LOX有協(xié)同作用，PLD可能為L(zhǎng)OX的反應(yīng)位點(diǎn)提供游離脂肪酸，兩者的協(xié)同作用會(huì)加速細(xì)胞膜磷脂的過(guò)氧化反應(yīng)進(jìn)程和降解速度，逐漸破壞細(xì)胞膜，引起冷害的發(fā)生[18]。

圖4 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)PLD活性(a)和LOX活性(b)的影響

2.5 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)細(xì)胞壁相關(guān)酶活性影響

冷害會(huì)影響果蔬的新陳代謝，導(dǎo)致番茄果實(shí)表面出現(xiàn)不正常成熟和損傷區(qū)域[26]，這些變化與細(xì)胞壁的完整性有關(guān)，其中果膠溶解和解聚作用的改變導(dǎo)致了上述癥狀的發(fā)生[21]。前人研究表明，PME、PG以及果膠裂解酶、半乳糖苷酶和阿拉伯糖苷酶等酶都參與了果膠的降解[21]，PG和PME酶活性越高，細(xì)胞壁破損程度越嚴(yán)重。KHADEMI等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PG通過(guò)促進(jìn)果膠的降解來(lái)破壞細(xì)胞壁。圖5-a表明，在整個(gè)貯藏周期，gib-3型番茄果實(shí)的PG活性顯著高于WT(P<0.05)，且在0～14 d呈急速上升的趨勢(shì)，14 d達(dá)到峰值，其中WT型番茄果實(shí)PG活性為8.07 U/g，gib-3型果實(shí)PG活性為16.83 U/g，是WT的2.08倍。由圖5-b可知，gib-3型番茄果實(shí)的PME活性顯著高于WT(P<0.05)。貯藏至21 d時(shí)，兩者的PME活性均達(dá)到最大值，其中g(shù)ib-3型番茄果實(shí)PME活性為354.11 U/L，WT型果實(shí)PME活性為312.54 U/L。以上結(jié)果表明，GA缺失會(huì)增大PG和PME的活性，加快番茄果實(shí)細(xì)胞壁降解速度，細(xì)胞壁破損現(xiàn)象嚴(yán)重，這與觀察番茄果實(shí)超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果相符合。

圖5 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)PG活性(a)和PME活性(b)的影響

生吉萍等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PG和LOX共同影響番茄果實(shí)的軟化，LOX加速脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基促進(jìn)了乙烯和脫落酸的生成，加速果實(shí)衰老；PG則加速果實(shí)細(xì)胞壁的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破損，使果實(shí)軟爛。在本研究中，gib-3番茄果實(shí)的LOX活性在貯藏21 d前持續(xù)增加，PG也保持著顯著高于WT的活性(P<0.05)，導(dǎo)致GA缺失型番茄果實(shí)軟爛程度嚴(yán)重，抗冷性下降。

2.6 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)抗氧化相關(guān)酶活性影響

有研究表明，低溫等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧和自由基的積累[28]。SOD和CAT等抗氧化酶能夠減少低溫脅迫引起的氧化損傷，對(duì)清除活性氧、自由基以保護(hù)細(xì)胞膜具有十分重要的作用[29]。圖6表明，2種類型的番茄果實(shí)的SOD和CAT活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在貯藏第7天時(shí)達(dá)到峰值，此后活性不斷下降。在整個(gè)貯藏周期，與WT相比，gib-3型番茄果實(shí)的SOD和CAT活性較低。在本研究中，gib-3的LOX活性顯著高于WT，加速了膜磷脂過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)程，產(chǎn)生了大量自由基；且gib-3的SOD和CAT活性顯著低于WT型，使得果實(shí)內(nèi)自由基清除系統(tǒng)無(wú)法清除大量累積的活性氧和自由基，導(dǎo)致gib-3番茄果實(shí)不斷遭受氧化損傷。因此，GA缺失會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)SOD和CAT活性的降低，不利于活性氧和自由基的清除，導(dǎo)致其在番茄果實(shí)內(nèi)不斷積累，增大了番茄果實(shí)遭受氧化損傷的程度，進(jìn)而使其抗冷性降低。

圖6 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)SOD活性(a)和CAT活性(b)的影響

2.7 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)抗逆相關(guān)酶活性的影響

PAL是苯丙氨酸生物合成途徑中十分重要的酶，對(duì)苯丙氨酸的生物合成起著重要的調(diào)節(jié)作用。低溫脅迫會(huì)刺激PAL活性上升，促進(jìn)苯丙氨酸的合成，提高植物的抗寒性[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫引起的PAL活性增加，可以產(chǎn)生大量苯丙烷代謝物，避免番茄果實(shí)遭受光損傷，減輕低溫引起的氧化損傷，從而提高果實(shí)的抗冷能力[31-32]。本研究中，低溫貯藏時(shí)，番茄果實(shí)的PAL活性受到誘導(dǎo)，故貯藏前期活性不斷增加，后期降低。由圖7-a可知，gib-3型番茄果實(shí)PAL活性顯著低于WT(P<0.05)，2種番茄果實(shí)的PAL活性在貯藏前期呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，第21天達(dá)到峰值，此后活性下降。貯藏21 d，WT型PAL活性為74.97 U/g，gib-3型番茄果實(shí)PAL活性為45.29 U/g，比WT低39.59%。另外，本研究中關(guān)于番茄果實(shí)抗氧化相關(guān)酶的生理指標(biāo)顯示，gib-3型番茄果實(shí)的SOD和CAT活性較低(圖6)，不利于清除番茄果實(shí)內(nèi)的活性氧和自由基；而gib-3型番茄果實(shí)中較低活性的PAL也無(wú)法減輕低溫引起的氧化損傷。以上結(jié)果表明，GA缺失會(huì)引起番茄果實(shí)內(nèi)PAL活性降低，加重番茄果實(shí)光損傷和氧化損傷的程度。

圖7 赤霉素缺失對(duì)番茄果實(shí)PAL活性(a)和GST活性(b)的影響

GST是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化劑之一，能清除過(guò)多的氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的抵抗能力[33]。GST作為一種重要的解毒酶，能夠減輕活性氧引起的氧化損傷，在生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)中具有舉足輕重的地位[34]。如圖7-b所示，gib-3番茄果實(shí)的GST活性顯著低于WT型(P<0.05)。在整個(gè)貯藏周期，2種番茄果實(shí)GST活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。其中WT型GST的活性在21 d達(dá)到峰值，此后緩緩下降；而gib-3型番茄果實(shí)GST活性在貯藏14 d就達(dá)到峰值，在后續(xù)的貯藏時(shí)期快速下降，但在14 d時(shí)仍比同期WT型的GST活性低8.52%。這表明，GA缺失會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)GST活性降低，不利于清除果實(shí)內(nèi)積累的活性氧和自由基，會(huì)加重番茄果實(shí)的氧化損傷，從而降低番茄果實(shí)的抗冷能力。

3 結(jié)論

研究表明，GA缺失加重了番茄果實(shí)的冷害癥狀，增大番茄果實(shí)冷害指數(shù)，且無(wú)法維持細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的完整性。另外，GA缺失使番茄果實(shí)的MDA含量、離子滲透率升高，促進(jìn)細(xì)胞膜磷脂相關(guān)酶PLD和LOX、細(xì)胞壁降解相關(guān)酶PG和PME活性增強(qiáng)，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性；且使細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶SOD和CAT、抗逆相關(guān)酶PAL和GST活性減弱，降低清除細(xì)胞內(nèi)積累的活性氧和自由基的能力，使番茄果實(shí)不斷遭受氧化損傷，降低番茄果實(shí)的抗冷性。因此，GA缺失型的番茄果實(shí)抗冷能力嚴(yán)重降低，進(jìn)一步說(shuō)明赤霉素在采后番茄抗冷調(diào)控中發(fā)揮了十分重要的作用。