高海慧，施 安，張立強(qiáng)，厲 龍，王培柱，吳學(xué)青，康曉冬

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏 銀川 720002；3.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，寧夏 平羅，753200；4.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏 吳忠 751100)

隱孢子蟲是一種細(xì)胞內(nèi)和胞質(zhì)外的寄生蟲，引起胃腸道功能紊亂導(dǎo)致幼畜和免疫功能不全人群的腹瀉[1]。隱孢子蟲是一種人獸共患致病原蟲[2]，廣泛寄生在多種動(dòng)物的消化道，病原體有直接的生命周期,可以在受感染動(dòng)物的胃腸道上皮細(xì)胞繁殖[3]，呈多國(guó)家多地區(qū)分布。無(wú)論是健康的還是腹瀉的一月齡以下犢?？赡艽嬖趥鬟f隱孢子蟲的危險(xiǎn)性[4]。通過卵囊污染的食物、飲用水、器具等傳播，新生犢牛免疫機(jī)制不完善，感染牛只可能引起嚴(yán)重腹瀉甚至導(dǎo)致死亡，同時(shí)會(huì)給人類帶來(lái)隱孢子蟲病的隱患。至今，世界上還沒有有效的藥物治療該病。

奶牛是寧夏的支柱產(chǎn)業(yè)，現(xiàn)有奶牛存欄量40.15萬(wàn)頭[5]，近年來(lái)關(guān)于寧夏犢牛隱孢子蟲分子特性鮮有報(bào)道，據(jù)此，為了初步明確寧夏地區(qū)犢牛感染隱孢子蟲的分子特性，本研究從8個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)，分年齡采集犢牛糞便，提取DNA，以隱孢子蟲18S rRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，進(jìn)行感染情況調(diào)查和蟲種鑒定，以期對(duì)犢牛隱孢子蟲的防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的采集2018年4月—2019年5月從寧夏3市采集樣品272份，用采便器直腸取樣，標(biāo)記年齡，地點(diǎn)，日期等信息放入冰盒送回實(shí)驗(yàn)室4℃保存，3～5 d內(nèi)提取糞便基因組DNA。

1.2 樣品DNA提取按照天根公司的糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，標(biāo)記詳細(xì)，分裝2份置于-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物的合成利用基于隱孢子蟲18S rRNA基因位點(diǎn)的引物，參照文獻(xiàn)[6]的記載，第1輪PCR的上游引物：5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′;下游引物：5′-CCCTAACCTTCGAAACAGGA-3′，第2輪PCR的上游引物：5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′;下游引物：5′- CTAATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：第1輪PCR反應(yīng)：25 μL反應(yīng)體系，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL10×Buffer，2.0 μL MgCl2(25 mol/L)，0.125 μL Ex-Taq酶(5 U/ μL)，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL。第2輪PCR反應(yīng)為25 μL體系，模板為第1輪PCR產(chǎn)物1 μL，其他同第1輪反應(yīng)。設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，含GelRed的1%瓊脂糖凝膠電泳，成像觀察結(jié)果。

1.6 序列測(cè)定及蟲種鑒定將電泳結(jié)果陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送上海生工生物股份有限公司雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果參照?qǐng)D譜校正后，在GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)，確定犢牛感染的蟲種。

1.7 種系發(fā)育分析在GenBank中查找隱孢子蟲的參考序列，利用軟件MEGA 5.1進(jìn)行種系發(fā)育關(guān)系分析，進(jìn)一步確定犢牛感染的隱孢子蟲蟲種。

1.8 數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及序列分析基于18SrRNA基因?qū)?72份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照、部分樣品成功擴(kuò)增出了大小約為830 bp的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)犢牛隱孢子蟲的陽(yáng)性率為12.88%，存在3種隱孢子蟲，分別為牛隱孢子蟲(CryptosporidiumC.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(Cryptosporidiumryanae,C.ryanae)和微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum,C.parvum)，感染率分別為54.29%，31.43%，20.00%。

圖1 部分陽(yáng)性樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.陽(yáng)性對(duì)照；2～5.陽(yáng)性樣品；6.陰性對(duì)照

2.1 不同地區(qū)隱孢子蟲感染情況試驗(yàn)選取寧夏3個(gè)市8家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，共采集糞便樣品272份，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品35份，陽(yáng)性率為16.89%。結(jié)果顯示：銀川市的場(chǎng)感染率高于其他2市，各市之間感染率差異不顯著(P>0.05 )，3個(gè)市犢牛感染的優(yōu)勢(shì)蟲種都是C.bovis，感染率分別為52%，60%，60%(表1)。

表1 不同地區(qū)犢牛隱孢子蟲感染情況

2.2 斷奶前后犢牛隱孢子蟲感染情況試驗(yàn)分別采集斷奶前、斷奶后樣品各99份、173份。研究發(fā)現(xiàn)斷奶前犢牛感染率(14.14%)，高于斷奶后犢牛(12.14%)，斷奶前與斷奶后感染率差異不顯著(P>0.05 )。斷奶前犢牛是C.bovis感染率最高，斷奶后犢牛是C.bovis和C.ryanae感染率相同，2個(gè)階段C.parvum的感染率均最低(表2)。

表2 斷奶前后犢牛隱孢子蟲感染情況

2.4 種系發(fā)育分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果說(shuō)明：35份犢牛陽(yáng)性樣品中，19個(gè)與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的C.bovis位于同一進(jìn)化枝上，11個(gè)與C.ryanae位于同一進(jìn)化枝上，5個(gè)與C.parvum位于同一進(jìn)化枝上，表明研究獲得3種蟲種，其中C.bovis的感染率最高，且3個(gè)市都發(fā)現(xiàn)C.bovis的感染，每市感染率差異不顯著(P>0.05 )，斷奶前與斷奶后犢牛都發(fā)現(xiàn)C.bovis的感染。

圖2 基于隱孢子蟲18S rRNA基因的種系進(jìn)化樹

3 討論

奶牛產(chǎn)業(yè)是寧夏的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，寧夏地域面積小，奶牛存欄量大，是我國(guó)著名的優(yōu)質(zhì)奶生產(chǎn)基地。牛的各種傳染病、寄生蟲病給奶牛產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了很大威脅，嚴(yán)重制約我區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)步上升。牛是哺乳動(dòng)物中普遍感染隱孢子蟲的一種，斷奶前犢牛是人畜共患病重要的直接宿主。犢牛隱孢子蟲病呈世界性分布，但感染率存在較大差異，我國(guó)多省市已有報(bào)道，感染率為1.0%～48.5%[2,7-10]。本研究結(jié)果顯示，寧夏3個(gè)地區(qū)隱孢子蟲的感染率為9.62%～16.89%，感染率差異不顯著，說(shuō)明選取的調(diào)查地點(diǎn)無(wú)地區(qū)差異。犢牛隱孢子蟲的感染率為16.89%，在我國(guó)處于中等偏下水平，斷奶前犢牛感染率為14.14%(14/99)，高于寧夏地區(qū)奶牛犢牛酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)的陽(yáng)性率8.75%(7/80)[11]，原因可能是檢測(cè)方法、采樣地區(qū)、采樣時(shí)間的不同。

牛的隱孢子蟲蟲種常見的有C.parvum,安氏隱孢子蟲(C.andersoni),C.bovis和C.ryanae[12]，4個(gè)蟲種的檢出與年齡有關(guān)，C.parvum在斷奶前犢牛中檢出率高，尤其是伴隨腹瀉的犢牛[13]，我國(guó)C.bovis的檢出率高于C.parvum[2,14-16]。本研究說(shuō)明，寧夏地區(qū)奶牛犢牛感染了C.bovis，C.ryanae和C.parvum，其中C.bovis檢出率最高，與我國(guó)C.bovis是優(yōu)勢(shì)蟲種一致，人獸共患的C.parvum為5株，存在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)安氏隱孢子蟲為斷奶后犢牛的優(yōu)勢(shì)蟲種[15-17]，本研究中斷奶前斷奶后犢牛都沒有分離出安氏隱孢子蟲。DAZ等[4]回歸分析表明，15～21 d的犢牛更容易感染隱孢子蟲。

本研究結(jié)果表明，寧夏奶牛犢牛隱孢子蟲的感染較普遍，存在3個(gè)蟲種的感染，分離到人獸共患的C.parvum5株，需要引起重視，牧場(chǎng)應(yīng)該加強(qiáng)防范意識(shí)，對(duì)隱孢子蟲病定時(shí)監(jiān)測(cè)，盡努力阻斷隱孢子蟲的傳播，為該病的有效控制打下基礎(chǔ)。