焦 哲，梁繼翔，嚴治山，劉曉麗，谷長勤，胡薛英，程國富，張萬坡

(華中農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，湖北 武漢 430070)

豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus，PSV)是小RNA病毒科薩佩羅病毒屬的一類無囊膜球形單股正鏈RNA病毒，主要通過糞—口傳播，引起腹瀉、肺炎、繁殖障礙等多系統(tǒng)綜合征或無明顯特征的亞臨床癥狀[1]。PSV可與豬細小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、腸道病毒等混合感染導致病豬臨床癥出現(xiàn)非典型癥狀[2-5]。由于PSV隱性感染以及混合感染往往使其造成的癥狀被掩蓋而被忽略，造成PSV感染擴散，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大威脅[6]。目前PSV普遍存在國內(nèi)規(guī)模化豬場中，華南、華東、西南等地豬場均有檢出，因此檢測PSV對其感染相關(guān)疾病的診斷十分重要[7]。原位雜交是目前最為有效的分子病理學、分子遺傳學技術(shù)之一，但目前為止國內(nèi)暫無PSV的原位雜交檢測方法的報道[8]。本研究建立了一種豬薩佩羅病毒的原位雜交檢測方法，為豬薩佩羅病毒在感染仔豬后器官和組織中病毒核酸分布及致病機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及抗體豬薩佩羅病毒及鼠抗PSV多克隆抗體由本實驗室保存。

1.2 動物試驗動物試驗遵循《湖北省實驗動物管理條例》中的規(guī)定，將經(jīng)PSV RT-PCR檢測陰性的21日齡的斷奶仔豬分成2組，每組3頭。感染組仔豬口服15 mL的 1×107TCID50/mL的PSV毒株，未感染組仔豬口服等量DMEM培養(yǎng)基作為對照。仔豬在接種后3 d后處死取其小腸組織甲醛固定后石蠟包埋。

1.3 主要試劑及儀器Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，購自美國Roche公司；原位雜交儀購于美國StaSpinAbboaThermoBrite；Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司；Phanta Max Master Mi購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上PSV的基因組序列，針對該病毒5′UTR基因序列利用DNAstar軟件設(shè)計1對特異性引物。采用BLAST工具初步驗證該引物的特異性。所設(shè)計的特異性上、下游引物序列分別為Sapelovirus-F:5′-ACACTCATTTCCCCCCTCCA-3′，Sapelovirus-R:5′- CGCCGAAGCGCGTCGCTAAC-3′，預期擴增的目的片段的長度為200 bp。上述引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 特異性探針的制備

1.5.1病毒RNA提取 取PSV病毒液200 μL，按全式金公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書進行抽提，病毒核酸抽提液立即用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑進行cDNA的合成。

1.5.2PCR擴增目的條帶 取1.5 μL cDNA用設(shè)計好的引物(F/R)進行PCR擴增，擴增程序如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用OMEGA公司DNA凝膠回收試劑盒回收特異的目的擴增片段。

1.5.3DNA探針的標記 使用分光光度計測定PCR回收產(chǎn)物濃度后，取1 μg PCR回收產(chǎn)物按Roche公司地高辛標記試劑盒說明書進行DNA探針標記。

1.6 原位雜交常規(guī)制作石蠟切片，參照文獻[9]對石蠟切片進行預處理后進行探針的雜交和顯色，通過Nikon 80i生物光學顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)觀察采集圖像，并進行結(jié)果分析。

1.7 免疫組化為驗證原位雜交結(jié)果準確性，對ISH檢測的組織連續(xù)切片進行免疫組化，以鼠抗PSV一抗4℃孵育過夜，HRP標羊抗鼠/兔IgG復合物作為二抗，DAB顯色后蘇木素復染，中性樹膠封片后光學顯微鏡觀察并采集圖像，并進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 動物試驗結(jié)果感染組仔豬在接種后第2天均出現(xiàn)腹瀉癥狀，采用孫杰等[10]建立的PSV RT-PCR方法對仔豬糞便進行PSV核酸的檢測，檢測的感染組3頭仔豬糞便擴增結(jié)果均為陽性，對照仔豬結(jié)果為陰性。

2.2 特異性探針的制備結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光檢測結(jié)果顯示，目的片段約為200 bp(圖1)，與預期大小是相符的。

圖1 PCR擴增目的條帶結(jié)果 M.DL2000 Marker；1.PSV；2.陰性對照

2.3 PSV原位雜交結(jié)果地高辛標記的DNA探針與組織內(nèi)PSV 的RNA特異性結(jié)合，經(jīng)NBT-BCIP顯色后呈藍紫色，感染組仔豬小腸大量絨毛上皮細胞內(nèi)見深藍紫色顆粒，雜交結(jié)果呈陽性 (圖2A)，腸絨毛固有層也有散在的陽性信號，陽性細胞主要是淋巴細胞和巨噬細胞(圖2B)；未感染PSV對照組未出現(xiàn)陽性信號(圖2C、D)。

圖2 PSV組織原位雜交結(jié)果 A、B.感染組小腸組織原位雜交結(jié)果；C、D.陰性對照組小腸組織原位雜交結(jié)果

2.4 PSV免疫組化結(jié)果對ISH檢測陽性的連續(xù)切片進行免疫組化染色。結(jié)果顯示，陽性信號呈棕黃色，位于小腸絨毛上皮細胞的胞質(zhì)中。觀察染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)這2種方法對PSV定位具有相同的結(jié)果(圖3)。

圖3 PSV組織免疫組化結(jié)果 A.感染組小腸組織原位雜交結(jié)果；B.連續(xù)切片免疫組織化學結(jié)果

3 討論

近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；l(fā)展，豬病毒性腹瀉的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[11]。許多學者和專家認為豬流行性腹瀉病毒、豬德爾塔冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等是引起該類疾病的主要病原體[12]，而PSV等豬腸道病毒卻一直沒有引起重視，導致可供參考的豬腸道病毒研究資料甚少[13]。

本試驗建立了組織中檢測PSV的原位雜交檢測方法，經(jīng)免疫組化檢測表明該方法具有很強的特異性，可用于PSV感染發(fā)病機制的研究和PSV實驗室診斷。試驗結(jié)果顯示，陽性信號主要在感染組仔豬小腸大量絨毛上皮細胞內(nèi)，這與KIM等[14]對PSV的免疫組化定位結(jié)果一致，研究表明，PSV以表面受體唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(α2,3-Linked Sialic Acid on GD1a Ganglioside)為受體進入宿主細胞，并且這類受體在豬腸道組織具有較高的表達，因此相較于其他組織，腸道黏膜上皮對PSV更易感[15]。本研究結(jié)果顯示腸絨毛固有層中的淋巴細胞和巨噬細胞胞漿也有散在的陽性信號，這說明小RNA病毒復制中間體是局灶性或彌漫性存在于這些細胞的細胞質(zhì)或細胞核中[16]。

我們利用PSV病毒為模板，通過RT-PCR擴增的方法直接用地高辛標記PCR產(chǎn)物合成PSV特異性探針，這種PSV特異性探針制備方法具有方便快捷的優(yōu)點。對福爾馬林固定的組織進行石蠟切片后與雜交的DNA探針相互作用，然后通過堿性磷酸酶標記的報告抗體用酶促反應顯示，可使用光學顯微鏡直接觀察，且ISH的優(yōu)點是永久性染色，信號不會隨著時間的推移而減少[17]。這種方法使用光學顯微鏡就可觀察結(jié)果，可以同時觀察組織形態(tài)且準確地反映病毒在組織中的狀態(tài)與細胞的分布，具有較廣泛的應用前景。