羅周正 張麗艷 李 賀 杜 波

（阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心（阜新市疾病預(yù)防控制中心）檢驗(yàn)檢測(cè)部，遼寧 阜新 123000）

流感在臨床上屬于流感病毒引發(fā)的一種急性呼吸道傳染病，因流感病毒屬于RNA病毒，且潛伏期短，傳染性較強(qiáng)及已發(fā)生變異等特點(diǎn)，一旦感染流感病毒，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，甚至威脅生命健康。臨床通常采取分離病毒、鑒定病毒或細(xì)胞培養(yǎng)作為檢測(cè)流感病毒的常用手段，但因消耗時(shí)間長(zhǎng)，特別是針對(duì)爆發(fā)疫情時(shí)難以滿足病毒診斷的要求。據(jù)有關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)室最新研究表示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用在臨床實(shí)踐中，除有操作簡(jiǎn)便、靈敏度及自動(dòng)化程度高外，還對(duì)核酸具備較高的擴(kuò)增性及檢測(cè)快等優(yōu)勢(shì)，深得廣大患者一致好評(píng)與認(rèn)可[1]。因此，為對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在流感病毒檢測(cè)中的診斷價(jià)值進(jìn)一步探討，本研究對(duì)我市哨點(diǎn)醫(yī)院采集疑似流感病毒樣本檢測(cè)后予以臨床分型，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧分析于2018年10月至2019年3月期間前來(lái)我市哨點(diǎn)醫(yī)院就診疑似流感病毒患者共530例納入本次實(shí)驗(yàn)，并對(duì)以上對(duì)象流感病毒樣本進(jìn)行采集。530例流感病毒樣本中包含男性患者330例、女性患者200例；科室包含兒科門(mén)診患者110例、內(nèi)科門(mén)診患者190例、呼吸科病房患者230例。以上所有標(biāo)本采集、存儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)雀黜?xiàng)操作均依據(jù)《甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案》有關(guān)文件進(jìn)行執(zhí)行。將采集的所有標(biāo)本及時(shí)送往流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室，并由檢驗(yàn)人員在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。針對(duì)未能在24h完成的檢驗(yàn)，應(yīng)置于-70 ℃的環(huán)境下冷凍保存。

1.2 檢驗(yàn)儀器與檢驗(yàn)方法

1.2.1 儀器型號(hào)與試劑：ABI 7500 Fast熒光PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)）；核酸提取采用RNA病毒提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司，貨號(hào)74104）；PCR反應(yīng)試劑（碩世生物科技有限公司）；狗腎傳代細(xì)胞（由遼寧省疾病預(yù)防控制中心感染與傳染性疾病防制所提供）[2-3]。

1.2.2 標(biāo)本采集和處理：采用核酸提取盒實(shí)時(shí)熒光定量PCR法提取樣本季節(jié)性H1亞型、季節(jié)性H3亞型、新甲H1亞型、H5、H7、H9等亞型檢測(cè)，且所有操作過(guò)程均依據(jù)試劑盒使用說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行操作[2]。按照說(shuō)明，將RNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄處理后擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為，50 ℃ 30 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)，55 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)，最后采取FAM信道在55 ℃下單點(diǎn)熒光檢測(cè)[3-4]。

1.2.3 病毒細(xì)胞分離鑒定：采集樣本中適當(dāng)加入10000 U/mL雙抗接種于單層狗腎傳代細(xì)胞，并注意觀察細(xì)胞病變，對(duì)病毒培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞凝血試驗(yàn)，結(jié)合細(xì)胞病變及細(xì)胞凝集進(jìn)行檢測(cè)。若凝集試驗(yàn)符合1∶16以上的細(xì)胞培養(yǎng)，可采用有關(guān)亞型標(biāo)準(zhǔn)血清給予紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)來(lái)作為流感病毒型別和亞型的鑒定[5-6]。

1.3 觀察指標(biāo)：統(tǒng)計(jì)兩組檢測(cè)方式對(duì)陽(yáng)性流感病毒及臨床分型（新甲H1型、H3亞型、B型）陽(yáng)性檢出率情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，卡方檢驗(yàn)以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；則兩個(gè)連續(xù)變量間呈線性相關(guān)時(shí)，使用Pearson積差相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 比較兩組檢測(cè)方法對(duì)流感病毒樣本不同分型檢測(cè)結(jié)果情況，見(jiàn)表1。

2.2 比較兩組檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性流感病毒不同分型檢出率情況，見(jiàn)表2。

表1 兩組檢驗(yàn)方法流感病毒檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

表2 兩組檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性流感病毒不同分型檢出率對(duì)比（n，%）

3 討論

流感病毒最常用的檢測(cè)方法較多，包含PCR、血清學(xué)診斷以及細(xì)胞培養(yǎng)法，即可保證流感病毒的抗原性和原始標(biāo)本保持一致性，加上利于長(zhǎng)時(shí)間保存，能夠更好的對(duì)病毒抗原性及基因進(jìn)行分析。經(jīng)最新研究成果表明，因細(xì)胞培養(yǎng)法的檢出率受到大量病毒載量及樣本質(zhì)量影響，一旦樣本質(zhì)量低或病毒載量不夠時(shí)，極易存在一定的假陰性[7-8]。與此同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)法處于局限性，為確保病毒活性，只能單純用于活體病毒[9]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在臨床上主要適用于流感、禽流感、麻疹、手足口病等傳染性疾病診斷，且在食品安全上、科學(xué)研究等方面也發(fā)揮了重要作用[10]。本研究通過(guò)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，針對(duì)流感病毒鑒別多株多亞型流感病毒，具有實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要是通過(guò)擴(kuò)增至每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)，進(jìn)而能夠?qū)_(dá)到擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，伴隨產(chǎn)物的增多，進(jìn)一步促使熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，若經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)后，自然被熒光強(qiáng)度信號(hào)收集。較高的特異性及靈敏性[11-12]。經(jīng)國(guó)內(nèi)有關(guān)臨床實(shí)踐表示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有操作便捷、反應(yīng)速度快、具備較強(qiáng)的敏感性及直觀性，通過(guò)定量檢測(cè)深得臨床醫(yī)師及患者滿意的效果[13]。

本次研究證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組檢出89例陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為16.79%，其中包括新甲H1型71例、H 3亞型14例、B型4例；則參照組檢出57例陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為10.75%，包括新甲H1型52例、H 3亞型3例、B型2例，實(shí)驗(yàn)組高于參照組，P＜0.05。由此說(shuō)明，通過(guò)選自2018年10月至2019年3月對(duì)我市哨點(diǎn)醫(yī)院收集的530例疑似流感病毒攜帶者樣本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)出的陽(yáng)性率更高，且兩組均未查出H5、H7、H9型，且在進(jìn)入11月-次年1月份流感病毒的檢出率相對(duì)較高，是引發(fā)流感病毒的傳播及擴(kuò)散的最佳時(shí)機(jī)，冬季天氣寒冷，人體抵抗力減弱，容易受寒。加上，人們多半時(shí)間在室內(nèi)活動(dòng)，窗戶常管閉，導(dǎo)致空氣不流通，病毒更容易傳播。

綜上所述：較細(xì)胞培養(yǎng)法而言，選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR法應(yīng)用在流感病毒診斷中的臨床價(jià)值更高，值得進(jìn)一步推廣與借鑒。