袁馬馳 許國富

宮頸鱗癌臨床較為常見，發(fā)生具有雙峰的特征，病變形成與機體基因表達失常有關(guān)[1-2]。ARM 重復(fù)蛋白家族是腫瘤進展相關(guān)的蛋白質(zhì)，其含有多個Armadillo repeat 結(jié)構(gòu)，在正常機體中極少表達，在腫瘤細胞表達明顯上調(diào)，對細胞間通信有明顯的調(diào)節(jié)作用[3]。ARM 重復(fù)X 連鎖蛋白1（ARMCX1）是家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，細胞損傷后其分泌增多，對細胞增殖和細胞的遷移有明顯的促進作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是基質(zhì)金屬蛋白酶中的重要成分，具有顯著降解明膠的作用，還能引起IV 型膠原、基底膜的降解，同時對層粘連蛋白有一定的調(diào)節(jié)作用[4-5]。本研究探討宮頸鱗癌組織ARMCX1 和MMP-9 表達及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年1 月—2014 年2 月期間在杭州市第三人民醫(yī)院和浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診為宮頸鱗癌的患者67 例作為觀察組，選取同期確診為子宮肌瘤或子宮腺肌癥行子宮全切患者67 例作為對照組。均留取兩組的石蠟包埋組織和新鮮凍存組織（-80℃凍存）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，并取得患者知情同意。

1.2 納入、排除標(biāo)準 納入標(biāo)準∶（1）符合WHO 宮頸癌病理診斷標(biāo)準及分型；（2）術(shù)前未接受放療或化療；（3）均行宮頸癌切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)；（4）有完整的病理資料。排除標(biāo)準∶（1）轉(zhuǎn)移性鱗癌；（2）雙原發(fā)癌；（3）生殖系統(tǒng)畸形或發(fā)育異常；（4）1 個月內(nèi)使用過免疫抑制劑。

1.3 主要試劑 ARMCX1、MMP-9、二抗和DAB 均購自蘇州睿贏生物技術(shù)公司，ARMCX1 （批號RLT0331）和MMP-9（批號RLT1892），均為濃縮液。先行預(yù)實驗，選擇配比濃度ARMCX1（1∶200）和MMP-9（1∶100）顯色最理想的濃度用于正式實驗。

1.4 免疫組化實驗 基于石蠟包埋組織，應(yīng)用免疫組化SP 法檢測ARMCX1 和MMP-9 表達，DAB 顯色，嚴格按實驗步驟操作。二者的陽性部位是細胞質(zhì)，以淡黃-棕褐色定為陽性。

1.5 Western blot 實驗 基于新鮮凍存標(biāo)本檢測ARMCX1 和MMP-9 表達。嚴格按實驗步驟進行蛋白提取、蛋白濃度測定、蛋白變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)膜、免疫雜交后，取出膜后加入發(fā)光液，發(fā)光2min。將膜取出放入X 膠片盒曝光3min，顯影20s。應(yīng)用Image J 軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH 的灰度比值作為相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)分析，組間率的比較行卡方檢驗，兩組間定量資料的比較行配對t 檢驗和獨立樣本t 檢驗，多組間比較行方差分析，并應(yīng)用Pearson 相關(guān)分析和K-M 生存分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組患者年齡31～86（45.1±6.3）歲，體質(zhì)量42～87（55.1±10.5）kg，身高135～185（165.8±16.7）cm；病程1～4（2.1±0.3）個月。對照組年齡38～78（46.2±6.1）歲，體質(zhì)量41～80（54.7±13.4）kg，身高139～182（164.2±17.4）cm；病程1～4（1.8±0.2）個月。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 免疫組化結(jié)果 ARMCX1 蛋白定位于宮頸鱗癌的細胞漿和細胞膜，部分強表達的腫瘤在細胞核也能觀察到，均染成棕黃色，本組共65 例呈強陽性，2 例呈弱陽性。MMP-9 蛋白定位于宮頸鱗癌細胞的細胞漿和細胞膜，均染成棕黃色。ARMCX1 和MMP-9 在正常宮頸鱗狀上皮均不表達。見插頁圖1-4。

2.3 Western blot 法檢測兩組ARMCX1 和MMP-9蛋白表達量比較 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、插頁圖5。

表1 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表1 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；對照組為子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者；ARMCX1 為ARM 重復(fù)X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶-9

2.4 流式細胞檢測兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表2 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；對照組為子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者；ARMCX1 為ARM 重復(fù)X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶-9

2.5 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較 在不同脈管浸潤、病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組ARMCX1 和MMP-9 表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同增殖指數(shù)分組ARMCX1表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.6 觀察組ARMCX1 和MMP-9 表達相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性分析顯示，ARMCX1 和MMP-9 之間呈正相關(guān)性（r=0.43，P=0.034）。

2.7 ARMCX1 和MMP-9 表達生存分析 本組隨訪時間5～60 個月，經(jīng)K-M 生存分析顯示，ARMCX1（χ2=4.36，P=0.032）和MMP-9（χ2=5.02，P=0.013）表達與生存時間相關(guān)。見插頁圖6-7。

3 討論

宮頸鱗狀細胞常由鱗狀上皮內(nèi)病變（低級別和高級別病變）發(fā)展而來，與HPV 感染關(guān)系密切，最常見的是非角化型。病理形態(tài)上顯示腫瘤細胞的異型性明顯，浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移能力強，部分患者預(yù)后不良[6]。研究認為，鱗癌發(fā)生時多種蛋白表達出現(xiàn)異常，對促進病變進展有明確作用[7]。

ARMCX1 對組織的修復(fù)和細胞的分化均具有重要作用。有學(xué)者在神經(jīng)損傷的上皮中觀察ARMCX1的表達，認為其對線粒體的運輸能力有調(diào)控作用[8]。MMP-9 也稱為明膠酶B，是經(jīng)典的促進腫瘤遷移的蛋白，學(xué)者認為其在全身的大部分腫瘤中高表達，并能對底物進行溶解，使轉(zhuǎn)移的通路打開[9]。MMP-9 也具有癌基因樣的作用，具有促進細胞增殖，減少腫瘤細胞凋亡。由于間質(zhì)血管新生與腫瘤的形成密切相關(guān)，而MMP-9 對間質(zhì)中CD105 陽性的血管有明顯的促進作用[10]。MMP-9 在促進血管生成過程中可能與VEGF 的介導(dǎo)有關(guān)[11]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組兩種蛋白表達高于對照組（P 均＜0.05），提示ARMCX1 和MMP-9 高表達能促進宮頸鱗癌的形成，ARMCX1 和MMP-9 具有癌基因樣的腫瘤促進作用。腫瘤組織ARMCX1 和MMP-9 表達與病變的脈管浸潤（P＜0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），提示兩者對轉(zhuǎn)移和脈管浸潤有促進作用。ARMCX1 和MMP-9 可能是臨床判斷潛在轉(zhuǎn)移的分子因素。ARMCX1 和MMP-9 與病變的分型有關(guān)（P＜0.05），提示兩者可能是病理分型的鑒別抗體。臨床上非角化型癌的預(yù)后差，因此聯(lián)合檢測ARMCX1 和MMP-9 表達可能與預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)（P均＜0.05）。生存分析證實ARMCX1 和MMP-9 高表達患者的預(yù)后差，因此檢測組織ARMCX1 和MMP-9的表達可能是獨立的預(yù)后指標(biāo)，這為臨床判斷腫瘤的生物學(xué)行為提供了客觀依據(jù)。本研究結(jié)果還顯示，ARMCX1 表達與增殖指數(shù)有關(guān)（P＜0.05），提示ARMCX1 可能對促進細胞增殖有重要意義。ARMCX1 和MMP-9 具有正相關(guān)性（P＜0.05），提示二者具有正向協(xié)同作用。ARMCX1 可能是上游基因，調(diào)節(jié)MMP-9的表達，促進明膠、基底膜、IV 型膠原及層粘連蛋白的溶解，加速腫瘤性病變的進展。ARMCX1 對增殖和遷移的作用可能是間接的[12]。ARMCX1 分泌增加，引起腫瘤細胞生長和分化，腫瘤處于進展期[13]。MMP-9還可能是干細胞分化和調(diào)控的重要基因，如對細胞從幼稚向成熟分化，粘附分子的激活等。缺氧誘導(dǎo)因子也能激活MMP-9 的表達，對促進其分泌及功能有調(diào)節(jié)作用[14]。

表3 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表3 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；ARMCX1 為ARM 重復(fù)X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶-9

綜上所述，宮頸鱗癌組織ARMCX1 和MMP-9表達上調(diào)，兩者具有正向協(xié)同作用，術(shù)后檢測ARMCX1 和MMP-9 高表達患者的預(yù)后差。