陳 亮 趙賢寶 傅 超

甲狀腺癌是常見(jiàn)的一種頭頸部惡性腫瘤。目前，甲狀腺癌術(shù)前診斷主要依據(jù)針吸細(xì)胞學(xué)及甲狀腺彩超檢查，但具有明顯的局限性，并且容易出現(xiàn)假陰性。環(huán)氧化酶（COX）又稱為前列腺素H 合成酶，參與機(jī)體的各種生理過(guò)程，研究顯示，COX-2 在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，而其在甲狀腺癌中研究甚少。Ki-67抗原作為應(yīng)用最廣泛的腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志，與腫瘤細(xì)胞有絲分裂關(guān)系相關(guān)[1-2]。本研究旨在探討COX-2和Ki-67 在甲狀腺癌組織表達(dá)及臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇浙江省義烏市中心醫(yī)院腫瘤科2017 年6 月—2019 年6 月行手術(shù)治療的甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織作為觀察組，共87 例。甲狀腺癌依據(jù)《2010 年版甲狀腺腫瘤治療指南》[3]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇同期手術(shù)治療的甲狀腺良性病變的正常甲狀腺組織83 例作為對(duì)照組。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)∶（1）符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及術(shù)后病理證實(shí)為甲狀腺癌；（2）患者均行手術(shù)治療并獲得知情同意；（3）年齡≥60 歲且≤80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)∶（1）臨床資料不完整；（2）術(shù)前接受放療或化療者；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）手術(shù)禁忌者。

2 方 法

2.1 免疫組化法測(cè)定COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率取甲狀腺癌組織標(biāo)本和正常甲狀腺組織標(biāo)本，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片約為3μm，采用二甲苯脫蠟梯度乙醇脫水。將切片放于10mM、250mL 的檸檬酸緩沖液（pH=6）中，再將其放于高壓鍋（100℃）中煮沸30min 修復(fù)抗原，操作標(biāo)準(zhǔn)按照免疫組織化學(xué)SP 試劑盒（福州邁新生物試劑公司，批號(hào)1610272、1607131）嚴(yán)格進(jìn)行，采用DAB 顯色，蘇木精復(fù)染脫水，透明封固。COX-2 和Ki-67 結(jié)果判定[3]∶分別于高倍鏡下取不同視野5 個(gè)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)200 個(gè)，取平均值計(jì)算陽(yáng)性率。COX-2 和Ki-67均于細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[3]∶（1）著色程度∶以無(wú)色為計(jì)分0 分，以淡黃色為計(jì)分1 分，以棕黃色為計(jì)分2 分，以褐色與黑色為計(jì)分3 分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)∶以陽(yáng)性細(xì)胞＜10%為計(jì)分1 分，以陽(yáng)性細(xì)胞11%～50%為計(jì)分2 分，以陽(yáng)性細(xì)胞51%～75%為計(jì)分3 分，以陽(yáng)性細(xì)胞＞75%為計(jì)分4 分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及染色程度相乘∶其中以計(jì)分＜3 分為（-），以計(jì)分≥3分為（+）。

2.2 Western blot 測(cè)定COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值 取甲狀腺癌組織標(biāo)本和正常甲狀腺組織標(biāo)本加入細(xì)胞裂解液，勻漿裂解約35min，以離心轉(zhuǎn)速10000r/min，離心半徑15cm 離心5min，收集上清液進(jìn)行蛋白定量。取30μg 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，加入一抗COX-2 和Ki-67 孵育1h，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）二抗孵育1h，采用化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參照。兔抗人單克隆抗體COX-2 和兔抗人多克隆抗體Ki-67來(lái)源于北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司（批號(hào)1602181、1608292）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組研究對(duì)象一般資料比較 觀察組87 例，男20 例，女67 例；年齡60～78（69.43±5.64）歲；病程（3.17±0.76）年；TNM 分期[3]∶Ⅰ～Ⅱ期53 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例；包膜浸潤(rùn)30 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28 例。對(duì)照組83例，男16 例，女67 例；年齡62～79（70.31±6.27）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率比較 觀察組COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率比較[例（%）]

3.3 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較 觀察組COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

3.4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率比較 不同性別、年齡和TNM 分期COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較（）

表2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較（）

注∶觀察組為甲狀腺癌組織；對(duì)照組為正常甲狀腺組織；COX-2 為環(huán)氧化酶-2

3.5 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67蛋白表達(dá)灰度值比較 不同性別、年齡和TNM 分期COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)灰度值高于無(wú)包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

4 討論

COX-2 蛋白誘導(dǎo)型酶，其在細(xì)胞受刺激啟動(dòng)炎性反應(yīng)或機(jī)體出現(xiàn)腫瘤病變時(shí)急速合成，而其在細(xì)胞組織靜息時(shí)一般不表達(dá)[4]。COX-2 參與機(jī)體多個(gè)病理生理過(guò)程，并且熱休克蛋白、維甲酸、癌基因和脂多糖等多種因素均可誘導(dǎo)COX-2 合成[5]。近年研究顯示，多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)COX-2 高表達(dá)，認(rèn)為其可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性[6-7]。此外，COX-2 過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡且促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而使細(xì)胞增殖和凋亡間平衡失調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤走向惡性[8]。Ki-67 抗原主要由兩條多肽鏈組成，基因定位于10 號(hào)染色體，Ki-67 與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，其表達(dá)除G0 期以外的所有時(shí)期，于細(xì)胞周期G1 期開始，并且于S 期及G2 期逐漸增加至M 期達(dá)巔峰，目前是細(xì)胞增殖能力應(yīng)用最廣泛并且最具代表性的一種腫瘤標(biāo)志物[9-10]。臨床研究顯示，Ki-67 高表達(dá)不僅與腫瘤的生物學(xué)形成相關(guān)，并且與臨床預(yù)后密切相關(guān)[11]。Ki-67 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中與雌激素受體呈負(fù)相關(guān)，其可能與腫瘤分化程度相關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67 在甲狀腺癌研究中可反映甲狀腺癌細(xì)胞的增殖活性，可作為評(píng)估甲狀腺癌生物學(xué)行為以及惡性程度的一種重要指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率和蛋白表達(dá)灰度值高于對(duì)照組（P＜0.05），有包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移COX-2和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率與蛋白表達(dá)灰度值高于無(wú)包膜浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。提示甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 表達(dá)升高，COX-2 和Ki-67 異常表達(dá)可能參與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，且與淋巴轉(zhuǎn)移和包膜浸潤(rùn)相關(guān)，可作為判斷甲狀腺癌預(yù)后參考指標(biāo)。

表3 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 表達(dá)陽(yáng)性率比較[例（%）]

表4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較（）

表4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達(dá)灰度值比較（）