李良飛 金永軍 張秀峰 沈 忠

肛瘺是肛周皮膚與直腸肛管之間的慢性感染性病理管道。自隱窩理論[1]提出以來，普遍認(rèn)為其病因主要與肛腺感染有關(guān)，并且常于肛周膿腫破潰或切開引流后形成。肛周膿腫、肛瘺的本質(zhì)是細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)。促炎因子和抗炎因子之間互相影響、互相拮抗，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）作為炎癥連鎖反應(yīng)的啟動(dòng)因子，是重要的促炎癥細(xì)胞因子，而白細(xì)胞介素-4（interleukin 4，IL-4）是重要的抗炎細(xì)胞因子，參與各種炎癥反應(yīng)過程，炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)能準(zhǔn)確反映出患者局部炎性的嚴(yán)重程度及應(yīng)急過程[2-3]。本研究探討肛周膿腫膿腫壁、肛瘺瘺管組織TNF-α、IL-4 表達(dá)及意義，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2017 年1 月1 日—2017 年12 月31 日在杭州市第三人民醫(yī)院（安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院）住院行手術(shù)治療，經(jīng)病理確診肛周膿腫或肛瘺的全部患者資料，根據(jù)診斷及病程長短，分為肛周膿腫組、肛瘺病程＜3 個(gè)月組、肛瘺病程3～6 個(gè)月組、肛瘺病程＞6 個(gè)月組，再按照隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取30 例，共120 例肛周膿腫、肛瘺患者的臨床資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。所有患者簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）首次就診，術(shù)前行肛周B 超或MRI 或CT 明確診斷，且未曾使用過抗生素；（2）評(píng)估無明顯手術(shù)禁忌證；（3）手術(shù)取得相應(yīng)病理標(biāo)本送檢，病理診斷相符，且病理科留存相應(yīng)標(biāo)本。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）同時(shí)伴有炎癥性腸病、結(jié)直腸腫瘤以及肛周皮膚病等可能會(huì)影響研究結(jié)果的疾病的患者；（2）同時(shí)伴有凝血障礙等血液系統(tǒng)相關(guān)疾病患者，伴有心、肺、腦、肝、腎功能不全等嚴(yán)重全身性疾病患者，以及不能配合的患者；（3）為外傷導(dǎo)致的肛周膿腫和肛瘺以及結(jié)核桿菌等特異性感染者；（4）妊娠期、產(chǎn)褥期的婦女。

2 方 法

2.1 免疫組化 根據(jù)具體分組至病理科收集相應(yīng)的病理石蠟標(biāo)本，并由病理科協(xié)助切片備用。兔抗人TNF-α 多克隆抗體（貨號(hào)ab6671、批號(hào)GR235155-29）、兔抗人IL-4 多克隆（貨號(hào)ab9622、批號(hào)GR20231-51）購于英國Abcam 公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、免疫組化試劑盒（PV.6000）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)染色采用EnVision 兩步法∶脫蠟—水化、熱修復(fù)—阻斷過氧化物酶—磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗—滴加一抗37℃孵育—PBS 浸洗—滴加SP9000 通用型二抗37℃孵育—PBS 浸洗—DAB 顯色—蘇木素復(fù)染—乙醇脫水及透明—中性樹膠封片。

2.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿是TNF-α 陽性表達(dá)部位，IL-4 則主要在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿表達(dá)陽性（見插頁圖1-2），呈黃色、棕黃色、棕褐色表達(dá)。評(píng)分規(guī)則根據(jù)表達(dá)陽性細(xì)胞百分比和陽性染色強(qiáng)度綜合計(jì)分，根據(jù)表達(dá)陽性細(xì)胞百分比標(biāo)準(zhǔn)∶陽性細(xì)胞＜5%計(jì)0 分，陽性細(xì)胞6～25%計(jì)1 分，陽性細(xì)胞26～50%計(jì)2 分，陽性細(xì)胞51～75%計(jì)3 分，陽性細(xì)胞≥76%計(jì)4 分。表達(dá)陽性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)∶與背景均勻一致的淡黃色或無著色計(jì)0 分，呈淡棕黃色計(jì)1 分，呈棕黃色計(jì)2 分，呈棕褐色計(jì)3 分。無染色或者染色強(qiáng)度與背景無差異者為陰性。最終總分為兩項(xiàng)得分相加，根據(jù)最后得分來判斷表達(dá)結(jié)果∶0 分表示陰性（-），1～2 分表示弱陽性（+），3～4 分表示中度陽性（++），5～7 分表示強(qiáng)陽性（+++），所有結(jié)果經(jīng)2 次重復(fù)觀察，2 次計(jì)分不一致時(shí)，則重新觀察確認(rèn)，整個(gè)結(jié)果判讀請(qǐng)2 名副主任醫(yī)師以上職稱的病理科醫(yī)師協(xié)助完成。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，免疫組化染色陽性率結(jié)果的比較采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)不同病程TNF-α 與IL-4相關(guān)性分析則采用Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 四組肛周膿腫、肛瘺患者一般資料比較 肛周膿腫組30 例中，男20 例，女10 例，年齡15～78（38.40±18.15）歲；病程1～15（5.13±2.84）天；吸煙史23 例，飲酒史21 例。肛瘺病程＜3 個(gè)月組30 例中，男22 例，女8 例，年齡19～71（39.87±13.65）歲；病程7～81（43.03±26.53）天；吸煙史19 例，飲酒史22 例；單純性肛瘺24 例，復(fù)雜性肛瘺6 例。肛瘺病程3～6 個(gè)月組30 例中，男23 例，女7 例，年齡22～68（44.80±15.81）歲；病程3～6（4.57±1.09）個(gè)月；吸煙史27 例，飲酒史19 例；單純性肛瘺20 例，復(fù)雜性肛瘺10 例。肛瘺病程＞6 個(gè)月組30 例中，男26 例，女4 例，年齡18～68（41.23±12.65）歲；病程0.54～20（2.94±3.92）年；吸煙史25 例，飲酒史23 例；單純性肛瘺19 例，復(fù)雜性肛瘺11 例。四組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史等資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 四組肛周膿腫、肛瘺患者TNF-α、IL-4 表達(dá)陽性率比較 肛周膿腫組、肛瘺病程＜3 個(gè)月組、肛瘺病程3～6 個(gè)月組和肛瘺病程＞6 個(gè)月組TNF-α 表達(dá)陽性率分別為80%、90%、83%、73%，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組兩兩比較，肛周膿腫組與肛瘺病程3～6 個(gè)月組TNF-α 表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肛周膿腫組、肛瘺病程＜3 個(gè)月組、肛瘺病程3～6 個(gè)月組和肛瘺病程＞6 個(gè)月組IL-4表達(dá)陽性率分別為70%、83%、63%、50%，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組兩兩比較，肛瘺病程＜3 個(gè)月組與肛瘺病程＞6 個(gè)月組IL-4 表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表1-2，插頁圖1-2）。TNF-α、IL-4 陽性表達(dá)至頂峰后均呈下降趨勢(shì)，IL-4陽性表達(dá)率低于TNF-α，見插頁圖3。

3.3 肛周膿腫、不同病程肛瘺組織TNF-α 與IL-4表達(dá)相關(guān)性 不同病程階段TNF-α、IL-4 陽性表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析結(jié)果顯示，在不同病程階段TNFα 和IL-4 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.707，P＜0.05），見表3。

4 討論

肛周膿腫和肛瘺是發(fā)生于肛周的急慢性化膿感染性疾病，兩者屬于肛周間隙化膿性感染的不同病理階段，急性期表現(xiàn)為肛周膿腫，隨著病情進(jìn)展導(dǎo)致膿腫破潰、處理不當(dāng)以及急診膿腫切開引流，都可能進(jìn)一步形成肛瘺[5]。

表1 肛周膿腫、不同病程肛瘺組織TNF-α 表達(dá)陽性率比較

表2 肛周膿腫、不同病程肛瘺組織IL-4 表達(dá)陽性率比較

表3 肛周膿腫、肛瘺組織TNF-a、IL-4 陽性表達(dá)的相關(guān)性

肛周膿腫和肛瘺的本質(zhì)都是細(xì)菌感染，主要表現(xiàn)為局部炎癥反應(yīng)。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)的肛瘺瘺管病理標(biāo)本中可檢測到肉芽組織（75%），而肉芽組織提示局部往往有炎癥反應(yīng)[6-8]。另有研究表明，局部細(xì)菌入侵的直接損害一般主要表現(xiàn)在病程急性期，在肛瘺瘺管中，難以檢測到活細(xì)菌，但抗菌肽、細(xì)菌殘留物、炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β）等細(xì)菌成分或炎癥介質(zhì)可被檢測到[9-11]。

促炎因子和抗炎因子的相互作用是炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)，促炎因子主要有TNF-α、IL-6、IL-1 等，后者主要有IL-4、IL-10、IL-13 等[12-13]。TNF-α 主要來源于激活的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞，一般被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的始發(fā)因子。TNF-α 可增加中性粒細(xì)胞聚集，促進(jìn)下級(jí)細(xì)胞因子的釋放，如促進(jìn)IL-6、IL-1、氧自由基及IL-8 等炎癥因子的釋放，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)放大、遞增[2]。IL-4 是常見的抗炎細(xì)胞因子，由活化的CD4+細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性合成分泌，IL-4 是標(biāo)志性的輔助性T 細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞增殖和分化，參與炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等）的趨化和聚集過程，主要與免疫抑制有關(guān)，影響炎癥反應(yīng)主要是通過抑制輔助性T 細(xì)胞1（Th1 細(xì)胞）分泌相關(guān)促炎因子來達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的效果[3]。

本研究結(jié)果顯示，TNF-α、IL-4 在肛周膿腫和不同病程肛瘺中均有超過50%的陽性表達(dá)率，在膿腫急性期或肛瘺病程較短時(shí)期，局部炎癥反應(yīng)明顯，炎癥因子的陽性率都達(dá)到70%以上，與相關(guān)研究結(jié)果一致[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在肛周膿腫及肛瘺病程＜3 個(gè)月時(shí)TNF-α 表達(dá)陽性率呈升高趨勢(shì)，與臨床上有明顯不適癥狀的時(shí)期相符合，提示炎癥因子引發(fā)的組織炎癥反應(yīng)在肛周膿腫和肛瘺的發(fā)生、發(fā)展中起作用。而且TNF-α 在膿腫期與肛瘺病程3～6 個(gè)月期的陽性表達(dá)有差異（P＜0.05），表明促炎因子的變化與疾病病程有關(guān)。當(dāng)進(jìn)入慢性炎癥時(shí)，TNF-α 在組織中的陽性表達(dá)呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)?，促炎因子刺激?dǎo)致抗炎因子被激活產(chǎn)生，從而拮抗促炎因子的毒副反應(yīng)，使局部炎癥反應(yīng)減輕，細(xì)胞因子達(dá)到平衡。在本研究中，抗炎因子IL-4 的表達(dá)陽性率與TNF-α 的變化趨勢(shì)相似，都是在膿腫急性期及肛瘺病程＜3 個(gè)月時(shí)表達(dá)陽性率最高，在病程較長的組織中檢測到IL-4 表達(dá)水平呈下降變化。在進(jìn)一步分析TNF-α 與IL-4 陽性表達(dá)的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者的陽性表達(dá)呈正相關(guān)，說明在肛周膿腫、肛瘺的病程進(jìn)展中，TNFα 和IL-4 相互影響、相互拮抗，二者對(duì)肛周膿腫和肛瘺的發(fā)生和發(fā)展都發(fā)揮著重要的作用。

在炎癥反應(yīng)過程中，由于促炎因子和抗炎因子表達(dá)強(qiáng)度的不同，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸亦不同，當(dāng)前者占據(jù)主導(dǎo)地位時(shí)組織炎癥反應(yīng)往往會(huì)加重，而當(dāng)后者表達(dá)增加時(shí)，疾病則會(huì)趨于好轉(zhuǎn)。在肛周膿腫急性期中，細(xì)菌入侵，炎癥細(xì)胞被激活，使得促炎因子TNF-α 大量表達(dá)，導(dǎo)致組織炎癥加重，加重局部組織損傷，當(dāng)TNF-α 迅速表達(dá)，必然會(huì)引起抗炎因子的釋放，拮抗促炎作用，而隨著炎癥反應(yīng)趨向平緩，兩者的表達(dá)都會(huì)達(dá)到平頂峰臺(tái)期，使得炎癥反應(yīng)向有利于組織恢復(fù)痊愈的方向發(fā)展，這也符合炎癥反應(yīng)隨時(shí)間變化而變化的規(guī)律[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然IL-4在肛周膿腫和肛瘺病程前期的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，但其陽性表達(dá)的上升幅度不及TNF-α 明顯，而且在病程中后期的表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì)，難以拮抗促炎因子的致炎作用?？寡缀痛傺椎钠胶馐д{(diào)，在促炎因子迅速表達(dá)的同時(shí)，抗炎因子卻表達(dá)的上升強(qiáng)度不足，致使局部炎癥反應(yīng)持續(xù)反復(fù)存在，不能完全拮抗和抑制炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，局部組織損害引起的臨床表現(xiàn)呈持續(xù)態(tài)勢(shì)，導(dǎo)致肛瘺遷延不愈，這種不平衡的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果，可能是導(dǎo)致肛周膿腫及肛瘺發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了打破這一不平衡的趨勢(shì)，抗TNF-α 受體拮抗劑被相關(guān)學(xué)者研究，并用于相關(guān)炎性疾病的治療和臨床試驗(yàn)，但這些制劑在肛周感染性疾病中應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究和觀察[16]。

綜上所述，促炎因子TNF-α 與抗炎因子IL-4在肛周膿腫、肛瘺組織中都有較高的表達(dá)陽性率，在肛周膿腫、肛瘺的炎癥反應(yīng)應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，二者相互影響，相互作用，共同參與肛周膿腫、肛瘺的發(fā)生及發(fā)展。更多有關(guān)炎癥細(xì)胞因子在肛周膿腫、肛瘺組織中的表達(dá)、作用有待進(jìn)一步的深入研究。（本文已獲得第二作者單位授權(quán)。）