王 虎

（遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，沈陽 110032）

黃曲霉毒素B1（AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。AFB1是已知的化學物質(zhì)中致癌性最強的一種。AFB1對包括人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害[1-4]。目前，可用液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1，但需要大型的儀器設備，價格昂貴，操過過程復雜、時間長，且無法在現(xiàn)場和基礎小型實驗室使用[5-7]。也有采用黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒用于大量樣品的篩查，檢測快速，但操作復雜[8-9]。因此，急需一種既簡單快速，又能準確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析技術(shù)正好可以滿足需求[10]。本試驗擬建立一種飼料中黃曲霉毒素B1熒光定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

熒光免疫分析儀（蘇州和邁精密儀器有限公司），XH-C 渦旋混合器（新寶儀器有限公司），稱量天平（DIGITAL SCALE）。

1.1.2 主要試劑和耗材

黃曲霉毒素B1單克隆抗體和黃曲霉毒素B1半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，購自武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司；MES，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；EDC，購自國藥集團；試劑牛血清白蛋白，購自上海生工生物工程有限公司；時間分辨熒光微球，購自上海輝質(zhì)生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標準品，購自Sigma公司；硝酸纖維素膜，購自MDI。

1.2 溶液的配制

0.1 M 磷酸氫二鈉：Na2HPO4·12H2O 35.85 g·L-1，純化水溶解。微球洗滌液：MES 1.95 g·L-1，純化水溶解，1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.0。微球活化劑：EDC 76.68 g·L-1，純化水溶解，置于4 ℃保存。0.05 mol·L-1BB 9.0：十水合硼砂3.814 g·L-1，硼酸0.619 g·L-1，純化水定容至1 L 即可。微球封閉液1：牛血清白蛋白100 g·L-1，純化水溶解后置于4 ℃保存。微球封閉液2：甘氨酸75.07 g·L-1，溶解后置于4 ℃保存。標記復溶液：蔗糖100 g·L-1，海藻糖100 g·L-1，牛血清白蛋白20 g·L-1，PEG20000 5 g·L-1，PVP-K30 5 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 17 g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.414 g·L-1，溶解后加入PC300 3 mL，置于4 ℃保存。樣品墊處理液：Na2HPO4·12H2O 17 g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.414 g·L-1，蔗糖5 g·L-1，PEG20000 5 g·L-1，PVPk-30 5 g·L-1，檸檬酸三鈉3 g·L-1，PEG6000 1 g·L-1，casein 3 g·L-1，S9 1 g·L-1，S17 1 g·L-1，S21 1 g·L-1，Tween20 20 mL g·L-1。待以上試劑完全溶解，將玻璃纖維素膜浸濕，之后37 ℃干燥8～10 h 后，待用。樣品稀釋液：稱取NaCl 80 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g 和KH2PO40.24 g溶于800 mL 蒸餾水中，用pH 計測得溶液的pH 為7.4±0.2，然后再加P-300 300 μL，最后加純化水定容至1 L。樣品提取液：稱取Na2HPO4·12H2O 2.035 g和Na2HPO4·2H2O 0.050 g，用50 mL 純 化 水 全 部溶解后，再加甲醇700 mL，最后用純化水定容至1 L。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本處理方法

稱取研碎的樣本2.0±0.05 g 置于50 mL 離心管中，加入10 mL 樣本提取液，用振蕩器充分振蕩5 min，將振蕩后的樣本用定量分析濾紙過濾，用樣本稀釋液將濾液按1：7比例稀釋，取稀釋后液體進行檢測（稀釋系數(shù)40）。

1.3.2 操作步驟

打開熒光免疫分析儀，同時撕開檢測試紙鋁箔袋，取出檢測試紙，放于平整、潔凈的臺面上用配套吸管吸取待檢樣本，垂直而緩慢的滴加2～3滴（約60 μL）到加樣孔內(nèi)。靜置10 min，上機檢測。

熒光免疫分析儀操作：輕按開機鍵開機——點擊“系統(tǒng)設置”——點擊“檢測項目管理”——選擇需檢測的項目（黃曲霉毒素B1）——將檢測試紙插入檢測孔內(nèi)——點擊“快速測試”，開始檢測檢測下一個樣本，點擊“新測試”——點擊“快速檢測”即可。當檢測結(jié)果＞80 μg·kg-1時，可用樣本稀釋液將上述檢測液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被量的確定

用0.1 mol·L-1Na2HPO4將包被抗原（7 mg·mL-1）按 照0.21、 0.28 mg·mL-1和 劃 膜0.35 mg·mL-1，37 ℃干燥待用，與結(jié)合墊、樣品墊進行配對。結(jié)果顯示，選用0.28 mg·mL-1包被時，梯度添加標準品，靈敏度最高，結(jié)果見表1。

表1 不同包被量對檢測結(jié)果（T/C）的影響

2.2 標記量的確定

2.2.1 微球清洗

50 μL 熒光微球加入1 mL 0.01 mol·L-1MES 緩沖液中，混勻，12 000 r·min-1離心15 min；棄上清，加入0.01 mol·L-1MES 緩沖液1 mL，混勻離心；重復上述步驟3 次，并用0.01 mol·L-1MES 緩沖液1 mL 復溶。

2.2.2 微球活化

向清洗后微球加入250 μL·mL-1EDC 緩沖液，混勻，室溫避光反應30 min；12 000 r·min-1離心15 min，棄 上 清，加 入0.01 mol·L-1MES 緩 沖 液1 mL，混勻，2 000 r·min-1離心15 min。

2.2.3 微球標記

棄上清，用0.05 mol·L-1PB9.0 4 mL 進行復溶，均分至4 管分別加入0.3、0.4、0.5 μL 標記抗體（4.7 mg·mL-1），室溫避光反應30 min。

2.2.4 微球封閉

各加入100 μL 1 mol·L-1甘氨酸溶液混勻，室溫避光反應15 min；再各加入100 μL 10%BSA 溶液混勻，室溫避光反應15 min；12 000 r·min-1離心15 min。

2.2.5 微球復溶

將離心后微球用復溶液復溶后，按照3 μL·cm-1噴量噴出。

2.2.6 微球標記濃度檢測

與包被膜、樣品墊組合檢測結(jié)果顯示，標記抗體濃度是0.4 μL·mL-1時，梯度添加標準品，靈敏度最高，結(jié)果見表2。由表2 可知，最佳標記量是0.4 μL·mL-1。

表2 包被膜與標記抗體配對檢測結(jié)果

2.3 檢測結(jié)果分析

2.3.1 線性范圍與檢出限

取6個無污染（陰性）精料樣品和6個無污染（陰性）玉米樣品，分別添加黃曲霉毒素B1標準品0、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·kg-1，用黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標，以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標，擬合曲線并計算線性相關(guān)系數(shù)，見圖1。

計算得出糧食谷物的線性范圍：5～80 μg·kg-1，回歸方程：y=1.03x-0.15，相關(guān)系數(shù)r2=0.998。

2.3.2 準確性和重復性分析

在用GB/T 17480-2008 飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為0、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μg·kg-1的標準品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的檢測方法進行檢測。檢測結(jié)果見表3。

圖1 黃曲霉毒素B1標準品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系

表3 不同樣本檢測的準確性和重復性

從表1可以看出，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.7%～105%，3 次重復的變異系數(shù)＜14.4%。

2.3.3 與ELISA方法的對比試驗結(jié)果

取玉米粉、高粱、棉籽、甜菜粕、青貯玉米受污染樣品各1 份，先采用ELISA 法進行測定，再使用黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測定，檢測結(jié)果見表4。

表4 黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙與ELISA檢測值對比

由表4 可知，在不同的糧食谷物飼料中，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙與ELISA 的符合率為99.66%～111.87%，3 次重復的變異系數(shù)在13.68%以內(nèi)。

2.4 方法特異性

選擇其他5 種常見的真菌毒素的標準品在陰性玉米中進行添加，添加的濃度為1 000 μg·kg-1，然后用黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進行測試，每個樣品測3 次取平均值結(jié)果見表5。由表5 可知，與赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、嘔吐毒素、T-2 毒素、玉米赤霉烯酮毒素的交叉反應率均＜5%。試驗結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素幾乎無交叉反應，其方法特異性可以滿足檢測要求。

表5 交叉反應率

3 結(jié) 論

本研究研發(fā)了一種黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條，通過對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限為5 μg·kg-1，線性范圍為5～80 μg·kg-1，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.7%～111.87%，變異系數(shù)＜14.4%。與其他真菌毒素的交叉反應率均＜5%。其準確性和可靠性可以滿足我國對黃曲霉毒素B1的分析標準的技術(shù)要求。該方法具有簡單快速、準確可靠、重復性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測分析。