弓雪峰 任培中 崔紅生姜振遠(yuǎn) 張?jiān)婅?王佳美 張馨予 陳秋儀呂明圣 候 丹

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腦病科，濟(jì)南 250355)

支氣管哮喘(簡稱“哮喘”)是一種典型的心身疾病，長期反復(fù)發(fā)作影響心身健康[1]。隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏加快，承受社會壓力日益增大，焦慮、抑郁等相關(guān)的心理應(yīng)激[2]導(dǎo)致哮喘發(fā)病率逐漸升高[3]，心理問題成為哮喘預(yù)后不良的重要因素[4]。心理應(yīng)激哮喘作為新的表型，被認(rèn)為與“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫”(neuro-endocrine-immune, NEI)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡相關(guān)[5]。一方面哮喘可伴發(fā)焦慮、抑郁、恐懼等心理障礙，另一方面上述心理異常又成為誘發(fā)哮喘發(fā)作的重要因素，兩者之間互為因果，惡性循環(huán)，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈[6]。其治療方案除應(yīng)用β2受體激動劑、糖皮質(zhì)激素等控制與緩解之外，針對心理應(yīng)激哮喘的中醫(yī)藥深入研究迫在眉睫。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝肺生理相關(guān)，肺主治節(jié)而吐濁納清，肝主疏泄而調(diào)暢氣機(jī)，肝與肺共司氣機(jī)升降，若運(yùn)行正常，則氣血調(diào)暢；同時，肝肺病理相因，若樞機(jī)不利，則有木叩金鳴、木火刑金、風(fēng)搖鐘鳴等病理變化[7]。心理應(yīng)激哮喘患者素體肺氣壅塞，膈間膠固痰伏，遇情志不遂、肝氣失暢而誘發(fā)，肝木郁滯，反侮肺金，肺失肅降，氣逆于上，發(fā)為咳喘，核心病機(jī)在于氣郁痰阻，肝肺失和。首都國醫(yī)名師武維屏教授在“調(diào)肝理肺”的思想指導(dǎo)下創(chuàng)制了哮喘寧顆粒(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院內(nèi)制劑)，取法于四逆散與小柴胡湯，解肝氣之郁逆，調(diào)少陽之樞機(jī)，合炙麻黃、前胡等止咳平喘之品，共奏調(diào)肝理肺之功，臨床應(yīng)用三十余年，療效顯著，有效控制哮喘急性發(fā)作[8]，并可改善哮喘患者血瘀狀況[9]。本團(tuán)隊(duì)臨床研究[8]顯示，哮喘寧治療支氣管哮喘的臨床控制率與顯效率高，總有效率達(dá)90.0%，證明此復(fù)方不但抑制氣道免疫炎性反應(yīng)，而且還能夠通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)/干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)，促成機(jī)體免疫平衡；另一臨床研究[9]通過測定血流變相關(guān)指標(biāo)，得知哮喘寧顆粒可顯著改善哮喘患者血小板黏附，抑制血小板聚集。前期基礎(chǔ)研究[10-12]表明哮喘寧顆粒劑有上調(diào)哮喘大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體和血清皮質(zhì)醇的功能，也能夠下調(diào)氣道相關(guān)炎性反應(yīng)介質(zhì)如白三烯B4、白三烯C4、C-反應(yīng)蛋白等的表達(dá)[13]。但哮喘寧顆粒成分復(fù)雜，靶點(diǎn)眾多，對于防治心理應(yīng)激哮喘的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，建立“哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘”靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，通過基因?qū)用媾c富集分析闡釋哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘的潛在作用機(jī)制，以期為心理應(yīng)激哮喘提供中醫(yī)藥防治新思路。

1 材料與方法

1.1 篩選哮喘寧顆粒有效成分與潛在靶點(diǎn)

哮喘寧顆粒為北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院內(nèi)制劑。藥物組成：柴胡10 g、黃芩10 g、清半夏10 g、白芍10g 、枳殼10 g、炙甘草6 g、地龍15 g、炙麻黃6 g、葶藶子10 g、前胡10 g、丹參15 g。

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp. php)、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析網(wǎng)絡(luò)(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[14]等數(shù)據(jù)平臺檢索哮喘寧顆粒中所有藥物的全部化學(xué)成分。TCMSP數(shù)據(jù)庫以化合物口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和藥物相似度(drug likeness，DL)≥0.18 作為主要有效成分的篩選條件[15]。同時在BATMAN-TCM平臺對藥物進(jìn)行檢索，檢索條件為 score cutoff≥20，P-value cutoff<0.05；檢索的藥物成分通過OB≥30%和DL≥0.18篩選，得到對應(yīng)的化合物信息。將兩個數(shù)據(jù)庫的有效成分與預(yù)測靶點(diǎn)合并，建立哮喘寧顆?；瘜W(xué)成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。篩選、去重后獲得哮喘寧顆粒復(fù)方潛在靶點(diǎn)，利用Cytoscape3.7.2構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2 尋找心理應(yīng)激哮喘的疾病靶點(diǎn)

通過在Genecards基因數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database, TTD， http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database, CTD， http://ctdbase.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，http://www.omim.org/)以及 DisGenet(http://disgenet.org/)等數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)取并集，尋找與心理應(yīng)激哮喘疾病相關(guān)的人類靶點(diǎn)。

1.3 確定“哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘”藥物-疾病交集靶點(diǎn)

通過韋恩圖確定哮喘寧顆粒與心理應(yīng)激哮喘的藥物-疾病交集靶點(diǎn)及其對應(yīng)藥物主要化合物。通過SymMap數(shù)據(jù)庫(https://www.symmap.org/)查詢化合物CAS號。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)

將哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中，以中置信度分?jǐn)?shù)score≥0.4條件進(jìn)行篩選[16-17]，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，余參數(shù)不變，將得到的結(jié)果以文本形式導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中進(jìn)行可視化，并使用Cytoscape3.7.2的插件MCODE、cytohubba及拓?fù)溥\(yùn)算后篩選顯著性高的PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊，MCODE插件篩選標(biāo)準(zhǔn)為degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，K-score=2，max deapth=100，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；cytohubba插件篩選標(biāo)準(zhǔn)為計算節(jié)點(diǎn)分值排序后，取前10位顯著性基因；以拓?fù)溥\(yùn)算，得到中心度值(between centrality, BC)、親中心度值(closeness centrality, CC)、等級值(degree)，通過均值篩選。分別篩選基因后，取以上三者交集靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(Gene Ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析

利用David 6.8數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID, https://david.ncifcrf.gov/)[18]對哮喘寧顆粒和心理應(yīng)激哮喘共同作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶點(diǎn)的功能，KEGG富集分析可以得到哮喘寧顆粒和心理應(yīng)激哮喘共同靶點(diǎn)所富集的信號通路。GO和KEGG分析均以P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘寧顆粒主要有效成分篩選結(jié)果

通過在TCMSP及BATMAN-TCM平臺等檢索后合并信息，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(圖1)。在以上網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步篩選結(jié)果，共獲得哮喘寧顆粒中的主要有效成分39個(表1)，相應(yīng)潛在靶點(diǎn)121個。

2.2 心理應(yīng)激哮喘疾病靶點(diǎn)篩選

通過在Genecards、TTD、CTD、OMIM、DisGeNet等數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)取并集，共得到與心理應(yīng)激哮喘疾病相關(guān)人類靶點(diǎn)1 063個。

2.3 “哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘”藥物-疾病交集靶點(diǎn)

通過韋恩圖(圖2)找出哮喘寧顆粒和心理應(yīng)激哮喘交集靶點(diǎn)NOS2、PTGS1、F2ESR1、AR、PPARG、PTGS2、ADRB2、ESR2、DPP4、MAPK14、GSK3B、XDH、NOS3、F7、IL6等，共計72個。對應(yīng)哮喘寧顆粒藥物主要化合物有11個，詳見表2。其中，柴胡對應(yīng)蓽澄茄素、異鼠李素、茵陳黃酮，白芍對應(yīng)丁子香萜、β-谷甾醇、谷甾醇、山奈酚、兒茶素，枳殼對應(yīng)柚皮素、川陳皮素，麻黃、葶藶子對應(yīng)槲皮素。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

將72個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING中，結(jié)果如圖3(圖中線條顏色表示相互作用證據(jù)的類型),得到292對相互作用關(guān)系，將結(jié)果以文本形式導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用 Cytoscape軟件中的MCODE插件將哮喘寧顆粒靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，其聚類詳細(xì)信息見表3，得到顯著性最高的功能模塊(圖4)，用cytohubba插件得到前10位關(guān)鍵基因：MAPK1、TP53、TNF、VEGFA、EGF、IL1β、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6(圖5)。拓?fù)涞玫降年P(guān)鍵基因：F2、AR、CAT、MAPK1、TP53、TNF、VEGFA、EGF、IL1B、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6。三者交集的關(guān)鍵靶點(diǎn)為MAPK1、TNF、VEGFA、EGF、MAPK8、PTGS2、JUN、IL6。

圖1 哮喘寧顆?！八幬?成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Herb-component-target network of Xiaochuanning GranulePink arrow represents herbs contained in Xiaochuanning Granule, deep yellow rounded rectangles represents main active chemical components of herbs, blue ovals represents the corresponding targets.

表1 哮喘寧顆粒中的主要有效成分基本信息

續(xù)表1

圖2 哮喘寧顆粒與心理應(yīng)激哮喘靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Wynne diagram of targets of Xiaochuanning Granule and psychological stress asthmaBlue part represents the targets of Xiaochuanning Granule, bright yellow part represents the targets of psychological stress asthma, dark yellow part represents the common targets.

表2 共同靶點(diǎn)對應(yīng)哮喘寧顆粒主要化合物列表

圖4 基于MCODE插件的哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘基因互作模塊Fig.4 Gene interaction modules of Xiaochuanning Granule and psychological stress asthma based on MCODE plug-in

圖5 基于cytohubba插件得到前10位的哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘基因互作圖Fig.5 Top 10 genes interactions between Xiaochuanning Granule and psychological stress asthma based on cytohubba plug-in

2.5 哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘交集基因的GO與KEGG富集分析

2.5.1 GO功能富集分析結(jié)果

根據(jù)顯著性程度P<0.05(P值由小到大)進(jìn)行部分展示，GO分析結(jié)果提示哮喘寧顆粒-心理應(yīng)激哮喘交集基因的生物學(xué)過程(biological process，BP)顯著富集在耐藥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細(xì)胞增生的正調(diào)控、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板化、雌二醇反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、脂多糖介導(dǎo)的信號通路、MAPK通路激活、脂多糖反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；細(xì)胞組分(cellular component，CC)主要富集在質(zhì)膜、胞外區(qū)、細(xì)胞表面、分泌顆粒、突觸、軸突末端、突觸后膜、樹突細(xì)胞質(zhì)等；分子功能(molecular function，MF)主要富集在酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體活性、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、藥物結(jié)合、血紅素結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合等(表4、圖6)。

2.5.2 KEGG富集分析結(jié)果

KEGG富集分析得到通路98條，根據(jù)P<0.05并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選得到相關(guān)性較強(qiáng)的20條生物學(xué)通路(表5、圖7)。其中，相關(guān)疾病有查加斯病(Chagas’ disease )、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)等9種，信號通路主要有TNF通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)信號通路、腫瘤相關(guān)通路、神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、鈣離子信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)信號通路等。分析結(jié)果表明，哮喘寧顆粒可能通過T細(xì)胞受體介導(dǎo)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)活性配體受體相互作用等通路起到防治心理應(yīng)激哮喘的作用。

3 討論

中藥復(fù)方在分子水平上是多組分、多靶點(diǎn)的藥物集合，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)逐漸成為目前對中醫(yī)藥(尤其是復(fù)方等)的重要研究方法，在分子水平和生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)背景下研究中藥作用機(jī)理[19]。本研究運(yùn)用此研究范式，以有效利用現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)信息，解釋哮喘寧顆粒治療心理應(yīng)激哮喘NEI網(wǎng)絡(luò)潛在機(jī)制。

表4 哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘的GO富集分析

續(xù)表4

圖6 哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis in the prevention and treatment of psychological stress asthma by Xiaochuanning GranuleGO： Gene Ontology.

表5 哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘的KEGG富集分析前20位通路

圖7 哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘的KEGG富集分析前20位通路Fig.7 Top 20 pathways of KEGG enrichment analysis in the prevention and treatment of psychological stress asthma with Xiaochuanning Granule KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; TNF: tumor necrosis factor; HIF: hypoxia-inducible factor; NOD: nucleotide-oligomerization domain； PI3K-Akt: phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B.

3.1 組方法度闡釋

首都國醫(yī)名師武維屏教授認(rèn)為支氣管哮喘發(fā)作的基本病機(jī)在于風(fēng)盛正虛、氣逆痰阻，而致肝肺失調(diào)，因此創(chuàng)制哮喘寧顆粒作為調(diào)肝理肺治療哮喘的代表方劑，崔紅生教授帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)守正創(chuàng)新，將之運(yùn)用于心理應(yīng)激哮喘的相關(guān)研究[20]。該疾病由情志因素誘發(fā)或加重，是肝氣失疏泄、情志欠調(diào)暢的表現(xiàn)，與肝聯(lián)系更加密切，應(yīng)當(dāng)以調(diào)肝理肺法治之[21]。哮喘寧顆粒謹(jǐn)遵此法，由四逆散、小柴胡湯等經(jīng)典名方加減化裁而成。柴胡、白芍、枳殼、炙甘草為四逆散易枳實(shí)為枳殼，《醫(yī)方集解》言之“甘草調(diào)逆氣，柴胡散陽邪，芍藥收元陰”，易為枳殼取其氣緩之意，降氣消痰，相合為用，疏肝解郁調(diào)和肝脾；且柴胡、黃芩、清半夏取小柴胡之意，和解少陽，調(diào)和樞機(jī)；葶藶子治痰壅喘咳，麻黃主宣肺平喘；黃芩、半夏、前胡合以清熱化痰降氣；地龍咸寒，寧肝熄風(fēng)，解痙平喘；益以丹參清熱涼血，活血祛瘀，蕩滌肺中瘀熱。全方和解樞機(jī)，清熱化痰，降氣平喘，共奏調(diào)肝理肺、止哮平喘之功。

3.2 作用網(wǎng)絡(luò)概覽

通過分析可知：哮喘寧顆粒治療心理應(yīng)激哮喘的有效成分包括蓽澄茄素、異鼠李素、茵陳黃酮、丁子香萜、β-谷甾醇、谷甾醇、山奈酚、兒茶素、柚皮素、川陳皮素、槲皮素等。支氣管哮喘是集氣道炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)[22]、氣道重構(gòu)于一體的慢性疾病，上述化學(xué)成分具有抑制氣道炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)氣道過敏反應(yīng)、改善氣道重構(gòu)狀況的作用，尤其在抑制氣道炎性反應(yīng)方面作用明顯。研究[23]表明，蓽澄茄素可保護(hù)神經(jīng)，減輕炎性反應(yīng)，是調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)的潛在成分；藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素與山奈酚可有效治療咳嗽，改善動物模型行為學(xué)表現(xiàn)，是治療哮喘和慢性支氣管炎的主要成分[24]。既往網(wǎng)藥研究[25]也證實(shí)槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇、谷甾醇是哮喘抑制免疫炎性反應(yīng)的有效化合物。

根據(jù)交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)對于此病治療具有代表性。譬如絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)、MAPK8、表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)主要與增生有關(guān)：MAPK一般參與細(xì)胞有絲分裂(本研究的GO分析生物學(xué)過程也富集得到MAPK通路)，即調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、炎性反應(yīng)[26]等多種細(xì)胞過程的三級激酶模式；在壓力環(huán)境中，應(yīng)激反應(yīng)可激活MAPK核心通路，通過RAS超家族GTP酶作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游激活因子，激活ERK通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增生，誘發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促成氣道重塑[21]；EGF可促使氣道平滑肌細(xì)胞增生，加劇氣道重塑[22]；啟發(fā)后期研究可通過調(diào)節(jié)這些靶點(diǎn)從而抑制氣道上皮增生、氣道重塑。TNF、IL-6、IL-1β等與炎性反應(yīng)密切相關(guān)[27]，藥物通過這些靶點(diǎn)抑制炎性反應(yīng)。另外關(guān)鍵靶點(diǎn)還有血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、前列腺素G/H合酶2 (prostaglandin G/H synthase 2,PTGS2)等。

3.3 潛在機(jī)制解析

GO與KEGG富集分析結(jié)果顯示，哮喘寧顆粒較多基因靶點(diǎn)富集在與神經(jīng)機(jī)制、免疫炎性反應(yīng)、細(xì)胞增生等相關(guān)的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、信號通路與疾病。此即表明哮喘寧顆?？赡芡ㄟ^相關(guān)靶基因來調(diào)節(jié)所對應(yīng)信號通路，從而調(diào)控免疫，抑制炎性反應(yīng)，發(fā)揮防治心理應(yīng)激哮喘的作用。

神經(jīng)機(jī)制方面，GO富集所得細(xì)胞組分有突觸、不對稱突觸、突觸后膜、軸突末端等神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)，生物學(xué)過程有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，分子功能涵蓋配體激活的的序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，KEGG富集可知信號通路涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、HIF-1信號通路等。哮喘中刺激物敏感性增加和氣道反應(yīng)性增強(qiáng)的關(guān)鍵機(jī)制在于氣道神經(jīng)重構(gòu)，與富集結(jié)果相符[28]。最近有實(shí)驗(yàn)表明[29]大鼠哮喘模型予霧化吸入抗神經(jīng)生長因子可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路抑制氣道重塑。既往網(wǎng)藥研究[30]也表明哮喘與神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑高度相關(guān)，可通過該通路中的關(guān)鍵蛋白β-2腎上腺素能受體調(diào)節(jié)cAMP從而導(dǎo)致氣道平滑肌松弛，屬于β受體激動劑的分子靶標(biāo)；也可通過組胺H4受體影響卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型肺組織和氣道中嗜酸性粒細(xì)胞之浸潤以干預(yù)炎性反應(yīng)[30]。嚴(yán)重哮喘發(fā)作以缺氧為特征，通過特定的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1(由HIF-1α和-1β亞基組成的異二聚體)調(diào)節(jié)，HIF-1α缺乏會導(dǎo)致Th17細(xì)胞減少，但會增強(qiáng)Treg細(xì)胞的分化并保護(hù)模型小鼠免于自身免疫性神經(jīng)炎性反應(yīng)的侵襲[31]。有研究者[32]在Science發(fā)文指出肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(pulmonary neuroendocrine cells, PNEC)作為特殊的氣道上皮細(xì)胞，可放大過敏性哮喘反應(yīng)：PNEC缺失的小鼠過敏性哮喘模型，能夠減少杯狀細(xì)胞增生，致使2型免疫反應(yīng)明顯減弱，從而提出PNEC通過分泌神經(jīng)肽與神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，與2型固有淋巴細(xì)胞共同構(gòu)成神經(jīng)免疫模塊對氣道刺激做出應(yīng)答。

免疫炎性反應(yīng)方面，GO富集得到樹突細(xì)胞質(zhì)、分泌顆粒等與“免疫-內(nèi)分泌”有關(guān)的細(xì)胞組分，KEGG富集得到TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、鈣離子信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等與免疫炎性反應(yīng)密切相關(guān)[33]，其間存在多重交互作用。①TNF信號通路介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)、細(xì)胞免疫等病理過程，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的功能，在哮喘治療中發(fā)揮潛在作用。心理因素如抑郁癥狀相關(guān)的IL-1β(本研究基于cytohubba得出)和TNF-α的釋放與哮喘氣道炎性反應(yīng)相關(guān)，作為哮喘神經(jīng)心理表型的靶向生物標(biāo)志物[34]，與心理應(yīng)激哮喘相聯(lián)系。另有研究[35]證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)的蛋白3是兒童哮喘加重的關(guān)鍵因素。②NOD樣受體信號通路的激活促支氣管哮喘加重[36]。NOD樣受體蛋白3的抑制與細(xì)胞凋亡的消失有關(guān)，嗜酸性哮喘小鼠模型中可抑制Th2反應(yīng)，并減少肺泡細(xì)胞的凋亡[37]。③Toll樣受體信號通路與機(jī)體的免疫性反應(yīng)密切相關(guān)， TLRs是模式識別受體，在病原體的檢測、反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，表達(dá)于固有免疫和獲得性免疫的各種細(xì)胞，參與識別病原微生物、調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答等反應(yīng)。有研究[38]表明TLR4、TLR5[39]、TLR7[40]與成人哮喘有關(guān)，可誘導(dǎo)各種促炎性反應(yīng)因子產(chǎn)生，肥大細(xì)胞增加；其中，TLR7激動劑在過敏性哮喘患者中已被證明可上調(diào)Th1反應(yīng)，下調(diào)Th2對過敏原的反應(yīng)[40]。④鈣離子信號通路可能與哮喘氣道高反應(yīng)性有關(guān)，而氣道炎性反應(yīng)正是氣道高反應(yīng)重要機(jī)制之一，通過調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)促使氣道高反應(yīng)[41]，應(yīng)用鈣離子通道阻滯劑可促進(jìn)哮喘患者肺功能的改善[42]。⑤HIF-1信號通路中，HIF-1α參與哮喘炎性反應(yīng)的過敏反應(yīng)[31]。⑥T細(xì)胞受體信號通路中Th1/Th2[43]以及Th17/Treg[44]細(xì)胞因子之間失衡是哮喘主要病理機(jī)制，上述通路均通過作用于此通路調(diào)控哮喘表型，故不作贅述。

細(xì)胞增生方面，GO富集得到細(xì)胞增生正調(diào)控、MAPK通路激活(3.2已討論)等生物學(xué)過程，涉及酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，KEGG富集得到PI3K-Akt信號通路在細(xì)胞的增生、分化、凋亡等方面有著重要作用。激活PI3K使Akt磷酸化，然后活化mTOR及其下游蛋白，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生長、增生、凋亡的調(diào)節(jié)。既往研究[45]表明抑制PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠恢復(fù)Th17/Treg平衡，而Th17/Treg細(xì)胞平衡對于防治哮喘起重要作用，高水平Treg細(xì)胞能夠抑制氣道平滑肌的過度增生以及氣道上皮組織纖維化，從而延緩氣道重塑，從而預(yù)防哮喘發(fā)病。其中，PI3K-Akt-mTOR信號通路對于氣道平滑肌的生長、增生過程很重要，用雷帕霉素阻斷mTOR可抑制哮喘氣道重塑[46]。

本研究創(chuàng)新之處在于重視中醫(yī)情志因素對發(fā)病的作用，針對哮喘的新表型——心理應(yīng)激哮喘，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討臨床行之有效的哮喘寧顆粒所構(gòu)成的作用網(wǎng)絡(luò)，闡發(fā)其潛在機(jī)制。不足之處在于目前尚未驗(yàn)證網(wǎng)藥結(jié)果所揭示的相關(guān)機(jī)制，擬在未來研究中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，心理應(yīng)激哮喘是由大腦對應(yīng)激形成神經(jīng)反射，通過NEI網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)Th2型免疫炎性反應(yīng)，造成發(fā)病或加重。哮喘寧顆粒防治心理應(yīng)激哮喘屬于多類組分、多種通路、多重靶點(diǎn)交互作用的復(fù)合機(jī)制。該藥可能通過多種有效成分作用于MAPK1、MAPK8、TNF、VEGFA、EGF等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體受體相互作用、TNF、NOD樣受體、Toll樣受體、鈣離子、T細(xì)胞受體、PI3K-Akt等信號通路，作用于神經(jīng)機(jī)制、免疫炎性反應(yīng)、細(xì)胞增生等方面，以綜合調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)，緩解應(yīng)激反應(yīng)，抑制氣道炎性反應(yīng)，延緩氣道重塑，從而為深入研究該方防治心理應(yīng)激哮喘的機(jī)制提供思路與依據(jù)。