劉 軍 曹慶飛 葉雄俊* 陳偉男 趙海岳 佟 明 王銀銀 黃曉波 常智杰

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院泌尿與碎石中心，北京 100034；2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧錦州 121001；3. 清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院膜生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一種源自近端腎小管上皮細(xì)胞的腎腫瘤，其中75%～80%是透明細(xì)胞RCC(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)[1]。近年來，腎癌發(fā)病率呈逐步上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計(jì)[2-3]，全球每年約有34萬～40萬名患者被診斷為腎癌，另有大約13萬～17萬名患者因罹患腎癌死亡。手術(shù)切除是早期腎癌的有效治療方法，然而，超過30%的腎癌患者在根治性腎切除術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移[4]，并且此類患者5年生存率很差[5]。腫瘤分子標(biāo)志物可以評估腎癌復(fù)發(fā)的可能，因此，發(fā)現(xiàn)與腎癌進(jìn)展相關(guān)的分子標(biāo)志物對于改善治療策略和判斷預(yù)后具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(cell-cycle-related and expression-elevated protein in tumor,CREPT)是酵母Rtt103基因的人類同源類似物，在人類多種癌癥中呈高表達(dá)狀態(tài)[6]。CREPT通過促進(jìn)細(xì)胞從G1向S期轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控細(xì)胞生長并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[6-7]。迄今為止，CREPT在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用還未見諸報(bào)道。本文擬研究CREPT在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)水平，探討CREPT表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年至2016年間在北京大學(xué)人民醫(yī)院接受了根治性腎切除術(shù)的90例患者為研究對象，所有患者均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為腎癌，手術(shù)前后均未接受過任何的輔助治療。其中男性57例，女性33例，年齡21～81歲(中位年齡58歲)。腫瘤的直徑為2.0～18.0(平均4.49)cm。本研究采用TNM分期系統(tǒng)對腎癌患者進(jìn)行分期，其中58例為Ⅰ期，7例為Ⅱ期，15例為Ⅲ期，10例為Ⅳ期。通過Fuhrman四級量表評估腫瘤的等級，41名患者為Ⅰ級，24名患者為Ⅱ級，14名患者為Ⅲ級，11名患者為Ⅳ級。90例患者中，透明細(xì)胞癌76例，乳頭細(xì)胞癌7例，嫌色細(xì)胞癌4例，其他組織學(xué)類型3例。

1.2 組織學(xué)檢查

將獲得的標(biāo)本固定在10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛中，常規(guī)處理進(jìn)行石蠟包埋，將蠟塊切成4 μm的組織切片，用蘇木精和伊紅染色后，由病理專家閱片診斷。

1.3 免疫組化及評估

首先將組織切片脫石蠟后再水合，然后在10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液中加熱切片2.5 min進(jìn)行抗原修復(fù)。用0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶后(10 min)，再用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，然后加入3E10(小鼠抗CREPT單克隆抗體)(由清華大學(xué)常智杰教授提供)，在4℃冰箱過夜。1∶100用PBS洗滌3次后，將樣品與小鼠二抗(1∶200，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)在室溫下孵育30 min。最后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，并用Meyer’s蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。PBS替換第一抗體獲得陰性對照。

CREPT的染色結(jié)果由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家以半定量方法評估，該病理醫(yī)師對患者的臨床病理分期和分級并不知情。病理參數(shù)采用陽性腫瘤細(xì)胞百分比(0%=0，1%～10%=1，11%～50%=2，51%～80%=3，81%～100%=4)和染色強(qiáng)度(陰性=0，弱=1，中等=2，強(qiáng)=3)進(jìn)行評估。兩個(gè)參數(shù)相乘，得出的免疫反應(yīng)性評分(immunoreactivity score, IRS)在0到12之間[8]。根據(jù)評分將CREPT分為低表達(dá)(IRS 0-6)和高表達(dá)(IRS 6-12)兩組。

1.4 隨訪

所有患者術(shù)后每六個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，直至死亡或復(fù)發(fā)。截至2018年12月,隨訪時(shí)間為8～53個(gè)月(中位時(shí)間23.5個(gè)月)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料計(jì)算百分比，組間構(gòu)成比較采用卡方檢驗(yàn)。通過Kaplan-Meier生存分析評估CREPT表達(dá)與生存率的關(guān)系，組間生存率比較使用Log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CREPT在腎癌及癌旁組織中的表達(dá)水平

將90例腎癌患者的癌及癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CREPT表達(dá)定位于腎癌細(xì)胞的胞核內(nèi)。用半定量的方法對比90例患者癌組織與癌旁組織中CREPT表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)46.7%的患者癌組織中CREPT表達(dá)為高水平(圖1A)，而在癌旁組織中，所有患者CREPT表達(dá)均為低水平(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

圖1 CREPT在腎癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異Fig.1 CREPT express level in renal cell carcinoma and adjacent tissues(DAB staining, 200×)A： CREPT is highly expressed in renal cell carcinoma; B： CREPT is lowly expressed in adjacent tissues; CREPT: cell-cycle-related and expression-elevated protein in tumor.

2.2 CREPT表達(dá)與腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系

將腎癌組織中CREPT表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組42例，低表達(dá)組48例。TNM分期高(Ⅲ/Ⅳ期)和Fuhrman分級高(G3/G4)的患者，CREPT的表達(dá)水平較高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CREPT的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小和組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)，詳見表2。

表1 90例腎癌組織與癌旁組織中CREPT表達(dá)情況

2.3 CREPT表達(dá)與腎癌患者預(yù)后的關(guān)系

截至2018年12月，85例患者完成隨訪，失訪5例。其中高表達(dá)組38例， 11例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，7例因腫瘤復(fù)發(fā)死亡。低表達(dá)組共有47例，3例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，僅1例死于復(fù)發(fā)。Kaplan-Meier分析顯示，CREPT高表達(dá)組患者的總生存時(shí)間(圖2A，χ2=5.319，P=0.021)和無瘤生存時(shí)間(圖2B，χ2=5.958，P=0.015)低于CREPT低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素COX回歸分析顯示，患者總生存時(shí)間及無瘤生存時(shí)間與CREPT的表達(dá)水平有關(guān)(P<0.05)，詳見表3、4。

表2 腎癌組織中CREPT表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 CREPT表達(dá)與患者生存時(shí)間之間的關(guān)系Fig.2 The relationship between CREPT expression and the survival of RCC patientsA: Correlation between CREPT expression and overall survival in RCC by Kaplan-Meier analysis; B: Correlation between CREPT expression and disease-free survival in RCC by Kaplan-Meier analysis; CREPT: cell-cycle-related and expression-elevated protein in tumor; RCC: renal cell carcinoma.

表3 多因素COX回歸分析患者總體生存時(shí)間影響因素

表4 多因素COX回歸分析患者無瘤生存時(shí)間影響因素

3 討論

近年來隨著診斷技術(shù)的提高，早期腎癌的臨床治療效果得以顯著改善，一旦腎癌出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的遠(yuǎn)期生存率將明顯受到影響[5]。因此，尋找與腎癌進(jìn)展相關(guān)的分子標(biāo)志物對于改善治療策略和判斷預(yù)后具有重要意義。

目前普遍認(rèn)為細(xì)胞周期的紊亂幾乎與所有人類腫瘤密切相關(guān)[9-10]。既往研究[11]證實(shí)，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)可促進(jìn)Cyclin D1過表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。

CREPT基因是含有RPR關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的酵母RTT103基因的人類同源基因，該基因定位于人第20號染色體長臂1區(qū)，編碼相對分子質(zhì)量約37 000的蛋白質(zhì)，由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院常智杰實(shí)驗(yàn)室克隆鑒定[6]。研究[6, 13]顯示，該基因能夠和轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵酶——RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ) 在細(xì)胞周期蛋白CyclinD1 基因的啟動(dòng)子上結(jié)合，并且使CyclinD1 基因形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成進(jìn)一步可能會(huì)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。越來越多的證據(jù)[6，14-16]顯示，CREPT與一些腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。CREPT作為Cyclin D1的調(diào)節(jié)因子，已被發(fā)現(xiàn)在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與胃癌患者的生存時(shí)間密切相關(guān)[6]。CREPT在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌及平滑肌肉瘤等腫瘤中均呈高表達(dá)趨勢，并且對腫瘤的惡性生物學(xué)行為具有促進(jìn)作用[14-16]。但是，迄今為止，腎癌組織中CREPT的表達(dá)情況尚不得而知，其表達(dá)水平是否與腎癌的臨床病理特征和預(yù)后判斷相關(guān)也亟待闡明。

本組資料結(jié)果顯示，46.7%(42/90)的患者癌組織中CREPT表達(dá)為高水平，而其他53.3%的患者CREPT表達(dá)為中低水平，究其原因，一方面可能因?yàn)槟I癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)參與的過程，另一方面可能因?yàn)槭炃衅瑫r(shí)間久遠(yuǎn)，可以采用新鮮標(biāo)本進(jìn)一步擴(kuò)大入組病例來完成。

單因素分析表明，CREPT的表達(dá)水平與腎癌的TNM分期和Fuhrman分級有關(guān)，與腫瘤大小和組織學(xué)類型無關(guān)。腎癌組織中CREPT的表達(dá)水平越高，則患者臨床分期越晚，F(xiàn)uhrman分級越高。本組90例患者中，≤4 cm腫瘤45例，>4 cm腫瘤45例；透明細(xì)胞癌76例，其他組織學(xué)類型14例。本組資料中，CREPT的表達(dá)與腫瘤大小和病理類型無關(guān)。

在隨訪期間，CREPT高表達(dá)組(38例)中有11例患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，7例因腫瘤復(fù)發(fā)死亡。低表達(dá)組(47例)中，3例患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，僅1例死于復(fù)發(fā)。多因素COX回歸分析顯示，患者總生存時(shí)間與無瘤生存時(shí)間與CREPT的表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-Meier分析顯示，高表達(dá)組患者的總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)。由此說明，CREPT高表達(dá)與腎癌的惡性病理特征相關(guān)，在本組病例中可以作為預(yù)后判斷的指標(biāo)，這些結(jié)果都提示CREPT對于腎癌的惡性生物學(xué)行為有顯著促進(jìn)作用。

CREPT促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚未完全闡明。已有研究[6]結(jié)果證實(shí)，CREPT能促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換和Cyclin D1的表達(dá)。常智杰等[6]通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)CREPT促進(jìn)細(xì)胞生長，克隆形成增多，腫瘤生長加快和細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換加速。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)[6]顯示，CREPT結(jié)合在Cyclin D1的啟動(dòng)子和poly A前面的區(qū)域。進(jìn)一步的3C實(shí)驗(yàn)[6，13]證明CREPT調(diào)控Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄是通過形成染色質(zhì)環(huán)，即：當(dāng)RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)到達(dá)Cyclin D1的啟動(dòng)子區(qū)，CREPT和RNAPⅡ相互作用，促進(jìn)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)RNAPⅡ到達(dá)Cyclin D1的poly A前面的區(qū)域，CREPT和RNAPⅡ相互作用，阻止 RNAPⅡ繼續(xù)前進(jìn)，通過染色質(zhì)環(huán)讓 RNAPⅡ又回到Cyclin D1的啟動(dòng)子區(qū)，從而加速Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄[6,13]。研究[6]還顯示， CREPT對Wnt/β-catenin 信號通路起促進(jìn)作用，過表達(dá) CREPT可以促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路激活，而敲低CREPT則抑制該通路激活。進(jìn)一步研究[17]顯示，CREPT可以與β-catenin和TCF4相互作用，并且促進(jìn)β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成及在靶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，從而增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。但是，在腎癌發(fā)生、發(fā)展過程中，CREPT具體通過哪種分子機(jī)制發(fā)揮作用，這兩種分子機(jī)制之間是否存在信息交換或者相互促進(jìn)，哪種機(jī)制在促進(jìn)腎癌的惡性生物學(xué)行為中起主導(dǎo)作用，將是本課題下一步重點(diǎn)研究方向。

總之，本研究首次報(bào)道了CREPT在腎癌組織中呈過表達(dá)現(xiàn)象，并且與患者的病理分期、分級和預(yù)后密切相關(guān)。因此，CREPT有望作為評估腎癌患者臨床預(yù)后的分子標(biāo)志物。