陳偉益,黃東益,吳文嬙,夏 薇,黃小龍,許 云,張榮萍

(海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228)

淮山(DioscoreaoppositeTbunb)為薯蕷科薯蕷屬草本植物，其塊莖含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、各種維生素和有益的微量元素，兼有糧食、蔬菜、藥用、保健、美容等功能[1].淮山炭疽病是淮山連作過(guò)程中需要克服的一大難題，因?yàn)檫B作不僅會(huì)導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)變化，而且還會(huì)造成土壤病原菌數(shù)量過(guò)多，致使有益菌減少，從而導(dǎo)致減產(chǎn)、品質(zhì)下降、發(fā)病率提高、經(jīng)濟(jì)效益下降等.其中，最具代表性的連作障礙為淮山炭疽病，該病是一種由炭疽菌引起的土傳病害，長(zhǎng)期連作可使土壤中病原菌的數(shù)量積累，在經(jīng)雨水、灌溉或風(fēng)力傳播后極易引起再次侵染，且其真菌孢子又難以祛除.

淮山炭疽病是一種由炭疽菌引起的土傳病害，長(zhǎng)期連作使土壤中病原菌的數(shù)量積累，經(jīng)雨水、灌溉或風(fēng)力傳播極易引起再次侵染，真菌孢子又難以祛除.黑鬼淮山成熟期早，口感鮮嫩，產(chǎn)量高但不易采收，且其連作病害常導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降，為受連作病害影響的代表品種.連作第二年，一般減產(chǎn)20%～30%，重病地塊連片落葉或枯死，是制約淮山(山藥)可持續(xù)發(fā)展的難題.

淮山連作病害的防治主要是從農(nóng)業(yè)生態(tài)、植物調(diào)控、生物、物理、化學(xué)等幾個(gè)方面來(lái)進(jìn)行[7].輪作、間作可調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)，改善土壤的微生物群落；對(duì)土壤成分進(jìn)行測(cè)量，按配方施肥，以調(diào)節(jié)土壤營(yíng)養(yǎng)；對(duì)栽培土壤進(jìn)行消毒以防線(xiàn)蟲(chóng)、土傳病等的危害.化學(xué)藥劑的效果較好，但對(duì)生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重；調(diào)理土壤需要較多的人力、物力、時(shí)間及先進(jìn)的技術(shù)手段；種植制度的調(diào)整需要因地制宜和技術(shù)支持，因此如何降低連作病害的影響值得探究.

殼聚糖(chitosans，CS)化學(xué)名稱(chēng)為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，又稱(chēng)脫乙酰甲殼素，是由幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)脫乙酰得到的.殼寡糖(Chitosan Oligosaccharides)又稱(chēng)殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是殼聚糖經(jīng)生物酶技術(shù)降解而得到.

殼聚糖及其衍生物對(duì)淮山炭疽病的防治效果尚未見(jiàn)報(bào)道，其對(duì)淮山炭疽病的防治機(jī)理暫不明確.為此，本試驗(yàn)采用病原菌離體培養(yǎng)與大田栽培相結(jié)合的方式來(lái)研究殼聚糖及其衍生物對(duì)連作淮山炭疽病的影響，以期為連作淮山的病害防治和淮山產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)品種為黑鬼淮山(無(wú)搭架)；材料有殼聚糖(CS，滬試)、殼寡糖(COS，山東綠隴公司提供)及禾甲安(CTS-N，山東綠隴公司提供，含有4%殼聚糖，2.5%苯扎溴安、10%復(fù)合氨基酸、0.1%銅、1.0%鋅)；從多年連作地塊患病植物的體內(nèi)分離、提純和鑒定的炭疽病原菌.

1.2 殼聚糖及衍生物對(duì)病原菌菌絲伸長(zhǎng)的影響

1.2.1 炭疽病原菌的分離、純化選取田間患病樣品，清洗后于病斑與健康組織相間位置切下邊長(zhǎng)5 mm的方形面積，于70%酒精中消毒20 s，用蒸餾水沖洗3遍，然后于0.1%Hgcl溶液中浸泡60 s，用蒸餾水沖洗3遍，將葉片貼于PDA平板內(nèi)，28℃培養(yǎng)3～5日，根據(jù)菌絲形態(tài)特征進(jìn)行初步篩選，并純化[13-17].

1.2.2 病原菌驗(yàn)證試驗(yàn)將提純出來(lái)的病原菌做成孢子懸濁液，于28℃振蕩培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行接種.接著將新鮮葉片采下，用解剖針刮傷植物表面，用事先培養(yǎng)好的孢子懸浮液噴灑葉面[18]，以無(wú)菌吸水紙包裹葉柄，然后將其放入塑封袋防止失水，每3天噴一次無(wú)菌水以防止失水.然后再反接回培養(yǎng)皿進(jìn)行純化，最后進(jìn)行檢測(cè)，若序列基本一致.可以確定此白色菌絲為本地淮山的炭疽病病原菌.

1.2.3 病原菌的鑒定菌絲培養(yǎng)4天左右，進(jìn)行DNA的提取.采用Chelex法[19]提取病原菌DNA，在560 bp左右出現(xiàn)條帶，然后進(jìn)行一代測(cè)序，引物為真菌通用引物.

測(cè)序結(jié)果拼接序列：ctTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTACAACCCTTT GTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGG GTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCA AAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAAT TGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGG CGGACCCTCTCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAA AACCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATcatagagccggagg aa

通過(guò)對(duì)比可以確定此序列可以代表炭疽菌屬，并且其與膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的相似度達(dá)到100%，故確定為膠胞炭疽菌.

1.2.4 殼聚糖對(duì)病原菌菌絲伸長(zhǎng)的影響用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定，在PDA培養(yǎng)基中加入5g/L、7g/L、9g/L、11g/L、13g/L、15g/L的殼聚糖、殼寡糖，并設(shè)置CK為1毫升1%的醋酸，各3個(gè)重復(fù).將病原菌用打孔器打下直徑為6 mm的菌餅，移到培養(yǎng)基中央，封口.28 ℃光照培養(yǎng)，并且每隔12 h測(cè)定一次菌落菌絲長(zhǎng)度.菌落菌絲長(zhǎng)度測(cè)量方法[20]：規(guī)則菌落直徑取平均值，不規(guī)則菌落直徑取(最長(zhǎng)直徑+最短直徑)/2.計(jì)算各個(gè)處理的抑菌率，如表1、表2.

抑菌率(growth inhibitory rate GIR)=[1-(d2-菌餅大小)/(d1-菌餅大小)]×100%.

其中d1為CK平板中菌落直徑，d2為加有殼聚糖或殼寡糖的平板中菌落直徑.

1.2.5 菌絲透射電鏡分析經(jīng)PB固定，酒精、丙酮脫水、丙酮滲透、60 ℃包埋、切片、鈾鉛雙染色，最后進(jìn)行觀察.

1.3 大田病情指數(shù)及防治效果的測(cè)定選取海南省海口市海南大學(xué)海甸校區(qū)薯蕷課題組內(nèi)連作五年以上的和炭疽病發(fā)病嚴(yán)重的地塊，取土進(jìn)行淺槽盆栽.于1～2月份進(jìn)行淮山種薯的處理，每段種薯約50～100 g，將傷口處沾草木灰，于晾干后播種，設(shè)8個(gè)處理：殼聚糖(CS)2.50 g/L、1.25 g/L、1.00 g/L；殼寡糖(COS)2.50 g/L、1.25 g/L、1.00 g/L；禾甲安(CTS-N)1.00 ml/L，以清水處理為對(duì)照CK.進(jìn)行常規(guī)管理，使用有機(jī)肥做基肥，并且每月追施一次復(fù)合肥料，期間不使用其他任何藥品處理.未發(fā)病期間每隔2周進(jìn)行一次處理，并待發(fā)病后記錄病情指數(shù).

以全株30%以上病葉病斑占全葉面積的比例計(jì)算[21-22]，其中，0級(jí)代表全株無(wú)??；1級(jí)代表全株10%的葉片感??；2級(jí)代表全株11%～30%的葉片感?。?級(jí)代表全株31%～45%的葉片感??；4級(jí)代表全株46%～60%的葉片感病；5級(jí)代表全株61%～80%的葉片感病；6級(jí)代表全株81%～95%的葉片感?。?級(jí)代表整株葉片幾乎全部枯萎或植株死亡.

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)級(jí)數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×7)×100.

防治效果=(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100.

1.4 數(shù)據(jù)分析采用Excel、SAS、Origin等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與整理.

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖及殼寡糖對(duì)炭疽病病原菌的抑制作用圖1為不同濃度的殼聚糖及殼寡糖對(duì)炭疽病病原菌的抑菌率變化曲線(xiàn)，從圖1可以看出，處理后炭疽病病原菌的抑制率先升高后降低，濃度對(duì)抑菌率的影響較大.圖1-A表明，15 g/L殼聚糖的抑菌率最高，5 g/L處理最低，第24小時(shí)抑菌率分別達(dá)到69.5%和47.5%，差異顯著，抑菌效果可持續(xù)36 h左右.圖1-B表明，殼寡糖的抑菌率比殼聚糖的抑菌率更高，持續(xù)效果更長(zhǎng)，處理后24 h其抑菌率達(dá)到64%～71%，處理后96 h仍能保持13.31%～39.98%的抑菌率，15 g/L處理的抑菌率持續(xù)最長(zhǎng)，0.5～0.7g/L處理抑菌率持續(xù)最低，差異顯著.

A殼聚糖抑菌率變化曲線(xiàn) B殼寡糖抑菌率變化曲線(xiàn)圖1 不同濃度殼聚糖處理對(duì)炭疽病病原菌的抑菌率變化曲線(xiàn) [注:圖中不同字母表示其差異性(p≤0.05)]

圖2 殼寡糖處理后第96小時(shí)的炭疽病病原菌示意圖

圖2為11 g/L的殼寡糖處理后第96天的炭疽病病原菌的示意圖，由圖2可以看出，與CK相比，在殼寡糖處理后菌絲的生長(zhǎng)受到抑制且菌絲顏色變黃，菌落形態(tài)不規(guī)則.

圖3為15 g/L的殼聚糖和殼寡糖分別處理后炭疽病病原菌的微觀結(jié)構(gòu)示意圖，從圖3可以看出，殼寡糖處理后，菌絲形態(tài)變化明顯，內(nèi)含物變少，菌絲壁變厚；對(duì)照組菌絲形態(tài)規(guī)則，內(nèi)含物豐富，代謝物較多；殼寡糖處理后，菌絲形態(tài)出現(xiàn)扭曲.

2.2 殼聚糖及殼寡糖對(duì)連作淮山炭疽病的防治效果圖4為處理后淮山炭疽病的病情發(fā)展曲線(xiàn)，圖4表明，發(fā)病后病情指數(shù)隨時(shí)間快速升高，處理濃度對(duì)病情發(fā)展有較大影響.其中，2.5 0g/L殼聚糖和1.00 ml/L禾甲安處理的病情指數(shù)持續(xù)最低，CK處理清水持續(xù)最高，差異顯著.

100806040200病情指數(shù)01428425670發(fā)病時(shí)間/(天數(shù))abbcbcbccdeCKCOS2.50g/LCOS1.25g/LCOS1.00g/LCS2.50g/LCS1.25g/LCS1.00g/LCTS-N1.00ml/L6040200防治效果/%aabaedccgeeffdb27d66dCOS2.5g/LCOS1.25g/LCS2.5g/LCS1.25g/LCS1.00g/LCTS-N1.00ml/LCOS1.00g/L殼聚糖(CS)、殼寡糖(COS)、禾甲安(CTS-N)圖4 殼聚糖及殼寡糖對(duì)淮山炭疽病病情指數(shù)的影響[注:圖中不同字母表示其差異性(p≤0.05)]殼聚糖(CS)、殼寡糖(COS)、禾甲安(CTS-N)圖5 殼聚糖及其衍生物于發(fā)病后27天、66天的防治效果[注:圖中不同字母表示其差異性(p≤0.05)]

圖5為發(fā)病后第27天、66天的防治效果，圖5表明，殼寡糖的防治效果優(yōu)于殼聚糖及禾甲安的防治效果，且其效果隨處理濃度的降低而降低，2.50 g/L殼寡糖與1.00 ml/L禾甲安的防治效果持續(xù)最長(zhǎng)，差異顯著.

如圖6，處理過(guò)后，2.50 g/L殼聚糖處理中炭疽病病斑數(shù)較CK處理的數(shù)量明顯減少，在2.5 g/L殼寡糖處理中，其病斑幾乎不可見(jiàn).

CK(左)，殼寡糖(COS中)，殼聚糖(CS右)圖6 同處理后淮山葉片示意圖

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論本試驗(yàn)初步得出，殼聚糖及殼寡糖可以抑制病原菌菌絲伸長(zhǎng)，改變菌絲結(jié)構(gòu)，處理24 h后抑菌率分別達(dá)到69.5和71%，抑菌持效期分別達(dá)36 h和84 h以上.抑制效果最好的為15 g/L殼寡糖，96 h后抑菌率仍可達(dá)39.98%；用殼聚糖、殼寡糖、禾甲安噴施處理連作淮山后，能有效抑制淮山大田炭疽病的發(fā)生，2.50 g/L殼寡糖和1.00 ml/L禾甲安處理的病情指數(shù)持續(xù)最低，在發(fā)病后第27天和第66天，防治效果依次為53.10、31.25和27.77、26.19.

殼聚糖及其衍生物對(duì)淮山連作炭疽病的防治具有顯著效果，2.50 g/L殼寡糖的防治效果最好.尹恒[17]等指出，殼寡糖對(duì)油菜菌核病的最佳濃度為50 g/L；康云艷[18]等指出，0.4 mg/L殼寡糖降低了菜薹立枯病的危害；葉磊等提出[19]由于殼聚糖及殼寡糖分子量的不同而導(dǎo)致了其效果存在差異.本試驗(yàn)得出的抗病最佳濃度與前人的結(jié)論存在差異，這可能是由于病原菌的種類(lèi)或殼聚糖及殼寡糖的分子量或脫乙酰度的不同而導(dǎo)致的.

殼聚糖及殼寡糖對(duì)炭疽病病原菌有顯著的抑制效果，15 g/L殼寡糖 48小時(shí)的抑菌率達(dá)到49.55%.胡國(guó)元[20]等得出：15 g/L殼寡糖在48 h時(shí)對(duì)煙草赤星病病原菌的抑制效果最優(yōu)，達(dá)到94.74%以上，這與本試驗(yàn)研究的結(jié)果相同.馬增新[21]通過(guò)4種青霉菌處理在離體實(shí)驗(yàn)中得出，殼聚糖的抑菌效果優(yōu)于殼寡糖，但是對(duì)不同種菌的影響存在一定差異，其對(duì)炭疽病病原菌的抑菌率低于其對(duì)赤星病病原菌的抑菌率，這可能是由于菌種的不同而導(dǎo)致的.

殼聚糖抑菌持效期低于相同濃度的殼寡糖抑菌持效期.通過(guò)對(duì)病原菌的離體培養(yǎng)得出，一周一次施用殼寡糖或禾甲安即可保證其防治效果；與其衍生物相比，殼聚糖對(duì)病原菌的持效期較短，易導(dǎo)致二次侵染或病害的大發(fā)生，一周內(nèi)需要處理多次或適當(dāng)調(diào)高處理濃度，才能保證其防治效果.但劉寶平等[22]對(duì)水稻白葉枯和細(xì)條病的研究證明，殼聚糖抑菌效果會(huì)隨濃度的增加而增加，但達(dá)到某一濃度后，濃度繼續(xù)增加其效果則會(huì)下降，因此殼聚糖的濃度增加需要有一定的理論支持.

殼聚糖及殼寡糖可通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性來(lái)改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞的正常新陳代謝，最終達(dá)到對(duì)病原菌菌絲伸長(zhǎng)的抑制效果，這與Liu J[23-25]等人的研究結(jié)果一致.殼聚糖及其衍生物還可抑制孢子萌發(fā)[26]，阻止患病植株病情的劇烈惡化以及二次擴(kuò)散，從而達(dá)到對(duì)淮山炭疽病的防治.

3.2 結(jié) 論本實(shí)驗(yàn)表明：殼聚糖及其衍生物對(duì)淮山炭疽病的防治有顯著效果，2.50 g/L殼寡糖的防治效果最好，達(dá)50%以上，15 g/L殼寡糖的抑菌率最高，96 h后抑菌率仍可達(dá)39.98%，殼聚糖及殼寡糖可通過(guò)抑制病原菌菌絲的伸長(zhǎng)而改變菌絲結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)連作淮山炭疽病的防治，其他防治機(jī)理尚有待后續(xù)研究.