王 鷺，李海平，周永燦,，孫 云，曹貞潔

(1. 海南大學 南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 ?？?570228;2. 海南大學 海南省熱帶水生生物技術重點實驗室， 海南 ?？?570228;3. 海南大學 海洋學院，海南 海口 570228)

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，隸屬鱸形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鯧鲹屬(Trachinotus)，俗稱金鯧，是一種暖水性中上層魚類，因其較快的生長速度及較高的經(jīng)濟價值而成為我國廣東、海南、福建等沿海地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要海水魚類之一.然而，隨著養(yǎng)殖密度的提高，病害問題已成為制約卵形鯧鲹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸[1].面對病害的肆虐，使用傳統(tǒng)抗生素依然是人們的首要選擇.但抗生素濫用所產(chǎn)生的藥物殘留、污染環(huán)境等諸多問題，已嚴重威脅人類健康[2-3].因此，迫切需要通過加強對養(yǎng)殖對象的免疫機制研究，通過全面系統(tǒng)地了解卵形鯧鲹免疫系統(tǒng)的結構、功能及作用機制，探索建立卵形鯧鲹等水產(chǎn)動物疾病安全高效的免疫防治方法，推動其養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展.

腫瘤壞死因子配體(Tumor necrosis factor ligand superfamily , TNFSF)是能夠誘導細胞發(fā)生凋亡、壞死、遷移、分化的一類細胞因子[4-9]，主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，此外，B淋巴細胞，T淋巴細胞和成纖維細胞等也可分泌產(chǎn)生[10-13].研究表明在人類中已鑒定出19種腫瘤壞死因子配體成員[14]，而在魚類中有超過14種被確認[15].TNFSF6是其重要的一員，它屬于Ⅱ型跨膜蛋白，由跨膜區(qū)、胞外區(qū)和胞漿區(qū)組成.研究表明，TNFSF6能夠通過與其受體相結合而誘導靶細胞凋亡，促進炎癥因子的產(chǎn)生，對腫瘤細胞具有殺傷作用[16-17]，并且對于維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)至關重要[18]，它除了參與細胞凋亡之外，還參與機體的非特異性免疫[19-20].目前，TNFSF6已相繼在羅非魚(Oreochromisniloticu)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、大頭鱈(Gadusmacrocephalus)等魚體中被克隆鑒定[21-23]，但在卵形鯧鲹中尚未見報道.本研究以卵形鯧鲹為對象，對TNFSF6基因進行了克隆，并進行原核重組誘導表達而獲得重組蛋白rTroTNFSF6.此外，本研究通過免疫小鼠制備了卵形鯧鲹TNFSF6多克隆抗體，這為深入研究TNFSF6的生物學功能及卵形鯧鲹的免疫調控機制奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物平均體重為(20 ± 0.8)g的健康卵形鯧鲹購自海南澄邁養(yǎng)殖廠，實驗開始前，暫養(yǎng)在養(yǎng)殖室水溫為26 ℃的充氣流動海水中一周；SPF級小鼠購自海南省藥物研究所，實驗開始前，暫養(yǎng)于25 ℃恒溫飼養(yǎng)房中.

1.1.2 質粒和菌株pET-32a載體由中國科學院海洋研究所惠贈；DH5α、EscherichiacoliBL21購自北京全式金生物公司.

1.1.3 實驗試劑與儀器TransTaq-T DNA酶、pEASY-T1 Simple克隆載體購自北京全式金生物公司；DNTP、限制性內切酶SmaⅠ、EcoR V、蛋白Marker 26610購自美國Thermo公司；核酸Marker DL 2000、T4 DNA連接酶、CIAP去磷酸化酶購自北京Takara公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；氨芐青霉素、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司；羊抗鼠IgG(HRP標記)購自美國ABclonal公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計根據(jù)卵形鯧鲹轉錄組測序獲得的TNFSF6基因序列，使用SMART在線網(wǎng)頁進行信號肽的預測，然后設計擴增引物TroTNFSF6-F/R，并在引物5′端插入酶切位點SmaⅠ(CCCGGG)，引物由華大生物公司進行合成(TroTNFSF6-F: 5′-CCCGGGGCCACCATGATCAACACTTACCAGACC-3′; TroTNFSF6-R: 5′-CCCGGGCAGTTTGTACATCCCAAAGG-3′).

1.2.2 卵形鯧鲹TNFSF6基因的獲得與序列分析以卵形鯧鲹cDNA第一鏈為模板進行TroTNFSF6基因的擴增，其中退火溫度為56 ℃.將PCR產(chǎn)物進行純化，并與pEASY-T1 Simple連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞中并置于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日挑取單菌落進行檢測并將陽性單菌落送華大生物公司測序.

1.2.3 重組質粒的構建將測序正確的菌株與含有pET-32a載體的菌株培養(yǎng)至生長對數(shù)期，提取其質粒并分別進行酶切，其中含有目的基因的質粒限制性內切酶為SmaⅠ，酶切溫度30 ℃，pET-32a酶切使用EcoR Ⅴ(GATATC)，酶切溫度為37 ℃，并使用CIAP酶對pET-32a進行去磷酸化.隨后使用T4連接酶將兩者酶切產(chǎn)物進行連接并轉化至DH5α，挑取陽性單菌落送至華大生物公司測序，并提取測序正確菌株的質粒轉化于BL21中，置于-80 ℃保存.

1.2.4 原核重組蛋白的誘導表達與純化將帶有重組質粒的菌株接種于5 mL 含有1‰ Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，向菌液中分別加入不同濃度的IPTG，置于不同溫度中誘導不同時間，其中陰性對照為不加入IPTG誘導劑誘導的菌液.誘導完成后，離心2 mL菌液以獲得菌體沉淀，加入80 μL pH為8.0的Buffer B緩沖液(100 mmol/L NaH2PO4, 100 mmol/L Tris, 8 mol/L Urea)并重懸，室溫震蕩裂解2 h，隨后12 000 × g離心20 min，取40 μL上清用于SDS-PAGE膠檢測有無誘導表達.確定最佳誘導條件后并按此條件進行大量誘導，誘導完成后離心50 mL菌液以獲得菌體沉淀，加入5 mL pH為8.0的40 mmol/L咪唑緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4, 2 mol/L NaCl, 40 mmol/L Imidazole, 7 mmol/Lβ-Me, 0.1% Tween-20)并重懸，置于-80 ℃預冷的酒精中速凍10 min，隨后取出置于4 ℃融化并超聲破碎至菌液透明.將超聲完成的菌液離心并分別處理上清與沉淀，SDS-PAGE檢測樣品中蛋白表達情況.使用Ni-NTA柱對重組蛋白進行純化，并將純化蛋白透析至PBS中，最后進行蛋白濃度測定.

1.2.5 多克隆抗體的制備將1 mL純化的蛋白(200 μg/mL)與1 mL弗氏完全佐劑混合并震蕩至乳化，然后多點皮下注射至小鼠體內，兩周后使用1 mL蛋白與1 mL弗氏不完全佐劑乳化混合液注射小鼠進行二次免疫，二次免疫一周后再次使用1 mL蛋白與1 mL弗氏不完全佐劑乳化混合液注射小鼠進行三次免疫.三次免疫一周后對小鼠進行眼球取血，而后獲得其血清并置于-80 ℃保存，其中陰性對照為采用相同方式向小鼠體內注射無菌PBS所獲血清.

1.2.6 多克隆抗體效價檢測采用間接 ELISA 法來檢測制備的多克隆抗體血清的效價.首先將純化后的重組蛋白rTroTNFSF6作為抗原包被至96孔板中，4 ℃孵育過夜后用PBST洗滌并甩干，隨后向每孔中加入封閉液PBST-BSA，37 ℃孵育2～3 h，完成后向每孔加入PBST進行洗滌，對制備的多克隆抗體血清分別進行1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000稀釋，并與蛋白進行抗原抗體反應，37 ℃孵育3 h，加入1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體稀釋液作為二抗進行ELISA反應，最后加入可溶性單組分TMB底物溶液避光10 min進行顏色反應，直至溶液出現(xiàn)藍色時加入 50 μL 的 2 mol / L H2SO4終止液， 以終止顏色反應，最后測定各孔在450 nm處的吸光值.

2 結 果

2.1 卵形鯧鲹TNFSF6基因的獲得以卵形鯧鲹cDNA為模板，TroTNFSF6-F/R為引物對目的片段進行擴增，凝膠電泳結果顯示擴增的目的條帶大小與預期的687 bp一致(圖1)，測序結果在NCBI比對分析表明該序列為TNFSF6.TroTNFSF6共編碼228個氨基酸，預測蛋白分子量約為25.5 kDa，理論等電點為8.9，SMART軟件預測該蛋白不含信號肽.

2.2 重組質粒的構建與鑒定目的片段與pET-32a載體進行連接后，使用通用引物T7/T7t對連接產(chǎn)物進行單菌落檢測，其凝膠電泳結果見圖2，目的片段插入原核表達載體的位點為EcoR Ⅴ，該位點到載體上游引物T7之間約600 bp，到載體下游引物T7 t之間約100 bp，均與擴增結果相一致，表明原核表達載體構建成功.

2.3 原核重組蛋白的誘導表達與純化經(jīng)DNASTAR軟件預測得知，原核重組蛋白rTroTNFSF6大小約為46.5 kDa，對重組蛋白進行小量誘導摸索其最佳誘導條件，結果發(fā)現(xiàn)當IPTG濃度為0.6 mmol/L，于20 ℃誘導8 h時蛋白表達量最高，SDS-PAGE檢測結果如圖3所示.

將原核重組蛋白按照最佳誘導條件進行大量誘導并進行蛋白可溶性鑒定.結果顯示，目的蛋白大多位于沉淀中，為變性蛋白(圖4A).進一步對變性蛋白進行純化，結果顯示純化得到的蛋白大小約46.5 kDa，與預測的原核重組蛋白大小一致，表明成功獲得純化的蛋白(圖4B).

2.4 多克隆抗體效價檢測采用間接ELISA檢測多克隆抗體的效價，結果顯示本研究所制備的TroTNFSF6多克隆抗體的效價較高，達到1∶32 000(表1).

表1 ELISA檢測多克隆抗體效價

3 討 論

腫瘤壞死因子配體TNFSF6是一類Ⅱ型跨膜蛋白，具有殺傷腫瘤細胞的作用，能夠參與細胞炎癥、細胞凋亡、淋巴細胞穩(wěn)態(tài)和組織發(fā)育等細胞信號傳導途徑[24-26].本研究中成功克隆了卵形鯧鲹TNFSF6基因，SMART在線網(wǎng)頁分析顯示TroTNFSF6結構中無信號肽，其中包含一個跨膜區(qū)，與關于羅非魚和牙鲆TNFSF6的研究結果一致[21-22].TroTNFSF6共編碼228個氨基酸，預測其蛋白質理論分子量為25.5 kDa.據(jù)報道，羅非魚TNFSF6的蛋白大小為26.3 kDa[21]，牙鲆的TNFSF6蛋白分子量為25.9 kDa[22]，大頭鱈的蛋白分子量為21.7 kDa等[23]，這些均與本研究獲得的卵形鯧鲹TNFSF6蛋白大小不一致，推測可能與魚的種類及TNFSF6的低保守度有關.pET-32a是一種良好的原核表達載體，本研究中我們將TroTNFSF6序列與pET-32a連接獲得重組質粒，并在BL21中進行誘導表達，實驗結果表明其最適誘導溫度為20 ℃，誘導時間為8 h，IPTG的最佳濃度為0.6 mmol/L.重組蛋白rTroTNFSF6的結果表明，其大小與預測的46.5 kDa一致，此外對該蛋白進行可溶性分析顯示rTroTNFSF6多以包涵體的形式存在.形成包涵體的原因可能有：(1)與其氨基酸序列有關，疏水性較高的蛋白質更能夠形成包涵體[27]；(2)與蛋白誘導量有關，表達量越高越容易形成包涵體[28]；(3)與培養(yǎng)條件有關，當誘導條件不佳時，容易形成包涵體[29].同時也有研究表明，包涵體中的大部分蛋白質同樣擁有部分功能，可以不用重新折疊[30].利用Ni-NTA層析柱對重組蛋白進行純化，將純化后的蛋白與弗氏佐劑相混合，三次免疫小鼠后獲得多克隆抗體，經(jīng)過ELISA檢測表明制備的rTroTNFSF6抗體效價高達1∶32 000，可用于后續(xù)對TroTNFSF6的功能研究.綜上，本研究成功獲得了TroTNFSF6多克隆抗體，為進一步研究其生物學功能以及卵形鯧鲹的免疫調控機制奠定了基礎.