王志鑫，李 姚，周留馨，任 利，曲 凱，苗 潤(rùn)，侯立朝，王海久，劉 昌，樊海寧

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，西寧 810000；2 青海省包蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；3 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，西安 710006

肝癌是全球性高發(fā)病率、病死率的惡性腫瘤之一，盡管部分患者可以通過(guò)手術(shù)治療達(dá)到根治，然而術(shù)后超過(guò)70%的肝癌患者可以發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，高達(dá)90%以上的死亡與腫瘤轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)有關(guān)[1]。研究[2]證明肝癌主要通過(guò)血行轉(zhuǎn)移，血小板可能在其轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，然而機(jī)制尚未明晰。本研究擬回顧性分析肝細(xì)胞癌患者外周血小板計(jì)數(shù)與臨床病理特征的關(guān)系，了解影響肝癌患者預(yù)后(整體、無(wú)復(fù)發(fā)生存期)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并進(jìn)一步分析血小板計(jì)數(shù)與患者生存期的相關(guān)性。此外，通過(guò)對(duì)比肝癌轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組患者外周血小板計(jì)數(shù)、聚集功能及血清游離5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)間的差異，進(jìn)一步了解血小板與肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時(shí)明確外周血游離5-HT與肝癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2004年1月-2012年12月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科、消化內(nèi)科、周?chē)芸浦委煹?10例肝細(xì)胞癌患者臨床資料。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)≥18周歲；(2)符合NCCN指南肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)初治病例，無(wú)既往腫瘤相關(guān)病史及治療經(jīng)過(guò)；(4)無(wú)其他影響血小板數(shù)量和功能的疾病：如原發(fā)性血小板增多癥；骨髓增生性疾病(例如慢性粒細(xì)胞白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、骨髓纖維化等)；血小板反應(yīng)性增多(如急性出血、缺鐵、急慢性感染及溶血等)；(5)無(wú)近/長(zhǎng)期可影響血小板功能/數(shù)量的藥物或其他治療。在收集的210例患者中選取52例肝細(xì)胞癌患者(包括20例肝癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者及32例非復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者)行外周血血小板聚集功能、游離5-HT檢測(cè)，病例需符合以下條件：(1)≥18周歲；(2)符合NCCN指南肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且此次入院明確診斷為肝癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移；(3)無(wú)其他影響血小板數(shù)量/功能的疾病：如原發(fā)性血小板增多癥；骨髓增生性疾病(如慢性粒細(xì)胞白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、骨髓纖維化等)；血小板反應(yīng)性增多(如急性出血、缺鐵、急慢性感染及溶血等)；(4)無(wú)近/長(zhǎng)期可影響血小板功能/數(shù)量的藥物或其他治療。

1.2 資料獲取及樣本檢測(cè) 利用醫(yī)院病案室病歷縮微系統(tǒng)，對(duì)病歷進(jìn)行篩選復(fù)合，將原始病歷資料建立原始數(shù)據(jù)庫(kù)，采集項(xiàng)目包含患者一般信息、入院時(shí)常規(guī)及腫瘤相關(guān)檢驗(yàn)、檢查數(shù)據(jù)。自收集患者病歷起，每3個(gè)月電話(huà)隨訪(fǎng)以及信訪(fǎng)，如果出現(xiàn)2年或者以上無(wú)法聯(lián)系者，則視為失訪(fǎng)。所有回顧分析的病例隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2014年12月31日，研究起始時(shí)間為接受主要的治療(手術(shù)/TACE/射頻消融/化療)，結(jié)束時(shí)間為患者死亡、最后1次隨訪(fǎng)時(shí)間或者失訪(fǎng)。隨訪(fǎng)內(nèi)容包括術(shù)后生活情況、復(fù)發(fā)時(shí)間、是否死亡、死亡時(shí)間及死亡原因。如果在隨訪(fǎng)期間患者死于原癌及相關(guān)疾病則患者資料為完全數(shù)據(jù)，如果至隨訪(fǎng)截止日期患者生存則按照截尾數(shù)據(jù)處理。

采集空腹外周靜脈血標(biāo)本5 ml 2管(采集前7～10 d患者未服用阿司匹林或含有阿司匹林的藥物)，采用SE 2100型全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)、使用血小板聚集儀檢測(cè)外周血小板聚集率。然后將試劑及血漿樣品置于室溫下(20 ℃～25 ℃)進(jìn)行溫度平衡，計(jì)算試劑用量，樣本與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行雙份實(shí)驗(yàn)，完成5-HT ELISA檢測(cè)。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：P-SL-2019072)，患者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)最終納入肝癌病例1102例，經(jīng)過(guò)篩選和隨訪(fǎng)，最終得到有效病例210例，一般資料見(jiàn)表1。

表1 肝癌患者基線(xiàn)資料

將210例患者分為低血小板組(≤150×109/L)129例(61.4%)與高血小板組(>150×109/L)81例(38.6%)，分析血小板計(jì)數(shù)與肝癌患者臨床病理特征間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同血小板水平患者的年齡(χ2=32.304，P=0.044)、腫瘤大小(χ2=35.201，P=0.001)、腫瘤數(shù)目(χ2=31.304，P=0.032)、Child分級(jí)(χ2=31.250，P=0.036)及TNM分期(χ2=35.201，P=0.001)等指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血小板與肝癌進(jìn)程關(guān)系密切。

2.2 肝癌患者預(yù)后影響因素分析 單因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、入院AFP水平、腫瘤大小、靜脈侵襲、入院血小板計(jì)數(shù)、TNM分期及治療方式為患者整體生存及無(wú)復(fù)發(fā)生存的危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，與患者生存相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素有年齡、入院AFP水平、入院血小板計(jì)數(shù)、治療方式(P值均<0.05)，而與無(wú)復(fù)發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括年齡、入院AFP水平、腫瘤大小、入院血小板計(jì)數(shù)、治療方式(P值均<0.05)(表2，3)。

2.4 外周血小板、血5-HT與肝癌患者復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的關(guān)系 對(duì)比分析20例住院的肝癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者及32例非復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者外周血小板計(jì)數(shù)、聚集功能的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組血小板計(jì)數(shù)、血小板聚集率、血清游離5-HT水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表4)。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清5-HT水平與外周血小板計(jì)數(shù)及最大聚集率均呈正相關(guān)(P值均<0.05)(圖2)。

3 討論

盡管目前針對(duì)肝癌已有多種治療措施，但包括移植在內(nèi)的手術(shù)治療、放療和化療[3]，均存在著應(yīng)用的局限性，較高的復(fù)發(fā)率以及治療的不徹底性，因此現(xiàn)有的治療方法都不能從根本上解決這一難題。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者從腫瘤微環(huán)境入手開(kāi)展了大量的研究工作，期待從新的角度揭示肝癌的起因及進(jìn)展機(jī)制，以期從中發(fā)現(xiàn)新的、更好的腫瘤治療靶點(diǎn)。

血小板廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，由巨核細(xì)胞生成，是血液循環(huán)中最小的血細(xì)胞。血小板早先是作為血液系統(tǒng)生理變化的主要參與者之一被認(rèn)知，其主要功能是阻止組織損傷及血管損傷后出血。近年來(lái)越來(lái)越多的研究將關(guān)注點(diǎn)放在血小板與腫瘤的關(guān)系方面。目前學(xué)界也有觀點(diǎn)認(rèn)為，血小板對(duì)腫瘤患者預(yù)后具有積極意義。例如，有學(xué)者[4]對(duì)216例結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移或者肝切除術(shù)后患者的預(yù)后進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，血小板數(shù)低于100×109/L的患者術(shù)后肝功能恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，且病死率更高，也有許多研究[5-8]支持血小板減少癥及低血小板水平對(duì)接受肝切除的肝癌患者預(yù)后具有不利影響的觀點(diǎn)。另外，研究發(fā)現(xiàn)在肝移植術(shù)后血小板輸注可以促進(jìn)肝再生[9]，而利用血小板特異性抗體減少血小板含量或用血小板活性抑制劑抑制血小板功能，均使小鼠部分肝切除后肝再生明顯降低[10]。提示血小板可能通過(guò)促進(jìn)肝再生對(duì)肝癌患者術(shù)后生存產(chǎn)生積極影響。

表2 影響肝癌患者生存的危險(xiǎn)因素分析

表3 肝癌患者無(wú)瘤生存危險(xiǎn)因素分析

表4 2組患者外周血5-HT及血小板相關(guān)指標(biāo)比較

目前幾個(gè)基于血小板的預(yù)測(cè)指數(shù)已經(jīng)被確定為肝癌的預(yù)測(cè)指標(biāo)，如Tamaki等[11]報(bào)道FIB-4>3.25可以增加約1.7倍的肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Sitia等[12]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)免疫介導(dǎo)的慢性HBV的小鼠應(yīng)用抗血小板藥物，如阿司匹林和氯吡格雷后，可以明顯抑制動(dòng)物模型肝癌的發(fā)生率。然而，還有相當(dāng)數(shù)量的臨床研究結(jié)果提示血小板對(duì)于肝癌患者預(yù)后有消極的影響，例如Nouso等[13]將血小板>80×109/L視為肝功能Child C級(jí)的肝硬化肝癌患者整體不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，而臨床觀察發(fā)現(xiàn)，高血小板水平在包括肝癌在內(nèi)的部分腫瘤(例如：子宮內(nèi)膜癌[14]、宮頸癌[14]、卵巢癌[15-16]乳腺癌[17]大腸癌[18]及胃癌[19]等實(shí)體腫瘤)中是預(yù)后不良因素，診斷時(shí)的血小板增多會(huì)導(dǎo)致許多類(lèi)型的腫瘤長(zhǎng)期存活率下降[20-22]。甚至還有基礎(chǔ)研究證實(shí)了血小板可以促進(jìn)肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。

由于血小板與肝癌患者預(yù)后關(guān)系的結(jié)論不一，本研究收集肝癌患者資料，進(jìn)行了相關(guān)性及預(yù)后分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板計(jì)數(shù)與肝癌患者整體預(yù)后及復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且血小板計(jì)數(shù)越高，其生存期越短、復(fù)發(fā)率越高，這與既往部分肝癌相關(guān)研究結(jié)果一致。

盡管既往研究報(bào)道血小板可以通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞，然而目前為止具體機(jī)制仍未完全明晰。通常認(rèn)為血小板通過(guò)活化形式發(fā)揮作用，其主要變化是血小板獨(dú)立分泌活性因子。其內(nèi)的大量α顆粒、致密顆粒等在活化狀態(tài)下向外釋放糖蛋白、凝血因子和許多促血管生成因子與抗血管生成因子等，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。5-HT是體內(nèi)重要的內(nèi)源性活性物質(zhì)，90%以上儲(chǔ)存在外周循環(huán)的血小板中，血小板是儲(chǔ)存和運(yùn)輸5-HT的重要物質(zhì)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，血小板源性的5-HT通過(guò)與其受體5-HT2A和5-HT2B結(jié)合，在大鼠肝臟的再生過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。此外，還發(fā)現(xiàn)5-HT與肝纖維化[24]、非酒精性肝炎及病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，甚至在腫瘤相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)血小板源性的5-HT能夠促進(jìn)包括膽管癌[25]和肝細(xì)胞癌[26]在內(nèi)的多種腫瘤生長(zhǎng)，且膽管癌患者血漿中高5-HT水平也提示預(yù)后較差[27]。與此同時(shí)，也有學(xué)者[28]認(rèn)為5-HT的表達(dá)水平與胃癌的分化程度密切相關(guān)。

基于上述原因，本研究推測(cè)血小板對(duì)肝癌進(jìn)程的影響可能與其內(nèi)所含的大量?jī)?nèi)源性5-HT密切相關(guān)，因此通過(guò)檢測(cè)對(duì)比不同組肝癌患者外周血小板計(jì)數(shù)、功能及5-HT水平及相關(guān)性對(duì)本研究的推測(cè)進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板計(jì)數(shù)、活化程度及5-HT水平在肝癌轉(zhuǎn)移組均較非轉(zhuǎn)移組偏高，還發(fā)現(xiàn)血清5-HT水平與外周血小板計(jì)數(shù)及聚集率均呈正相關(guān)。這提示血小板及5-HT與肝癌患者預(yù)后均存在密切關(guān)聯(lián)，提示血小板源性的5-HT可能在肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步研究提供了一定的基礎(chǔ)和依據(jù)。