郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，山西 太谷 030801）

0 引言

【研究意義】昆蟲氣味受體（Olfactory receptor,Ors）可識(shí)別氣味分子并將胞外化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，導(dǎo)致嗅覺受體神經(jīng)元（Olfactory receptor neurons,ORNs）產(chǎn)生動(dòng)作電位。在昆蟲體內(nèi)，氣味受體主要位于嗅覺神經(jīng)元樹突上，參與了嗅覺信號(hào)識(shí)別的初始過程。每個(gè)嗅覺神經(jīng)元表達(dá)兩類氣味受體：高度保守的共受體（Olfactory receptor co-receptor，Orco）和傳統(tǒng)的氣味受體（Conventional olfactory receptor，Ors）。傳統(tǒng)氣味受體可分為性信息素受體和普通受體[1]，在不同昆蟲間差異較大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蜜蜂氣味受體的研究，最早是Kriger等發(fā)現(xiàn)的意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmelOr2，其與果蠅（Drosophila melanogaster）Or83b和岡比亞按蚊AgOr7同源，在觸角毛型感器和板型感器中表達(dá)[2]。隨后意大利蜜蜂（Apis mellifera）中鑒定出177個(gè)Ors[3]，東方蜜蜂（Apis cerana）全基因組測序鑒定出119個(gè)Ors[4]。 與其他昆蟲相比，蜜蜂的氣味受體基因數(shù)量較多，這與蜜蜂群體內(nèi)化學(xué)通訊及蜜蜂和花之間的化學(xué)通訊存在著密切的關(guān)系。蜜蜂的氣味受體在其親屬辨認(rèn)、采集食物、工蜂監(jiān)督和防御等行為上起著重要的作用[5]，但是與果蠅和蚊子等其他昆蟲相比，有關(guān)蜜蜂Ors功能的研究很少。近年，對(duì)昆蟲氣味受體功能的研究除了采用生物信息學(xué)、體內(nèi)表達(dá)定位和基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白研究等方法，還將氣味受體基因?qū)氲教囟ǖ募?xì)胞或個(gè)體進(jìn)行研究。常用的異源表達(dá)細(xì)胞有人胚腎細(xì)胞（Human embryonic kidney 293 cell, HEK 293）[6]、HeLa 細(xì)胞[7]、爪蟾卵母細(xì)胞（Xenopus oocytes）[8]、猴胚腎細(xì)胞（COS-7），還有果蠅（Drosophila melanogaster）S2細(xì)胞[9]、草地夜蛾 （Spodoptera frugiperda）Sf9細(xì)胞[10]。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行氣味受體功能研究，常常需要在氣味受體基因N-末端加一段信號(hào)肽，還需要與編碼Gα蛋白基因共轉(zhuǎn)染，才能增強(qiáng)氣味受體蛋白在異源細(xì)胞中的表達(dá)[11]。而Sf9細(xì)胞來自于鱗翅目昆蟲草地夜蛾（Spodoptera fugiperda），可以為昆蟲氣味受體提供最優(yōu)的表達(dá)和膜定位條件[12]；且Sf9細(xì)胞表達(dá)了內(nèi)源性的共受體Or83b（傳統(tǒng)氣味受體正確行使功能所必須的）[13]；Sf9細(xì)胞貼壁生長在28℃、無需CO2條件下，而且能在質(zhì)粒和桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)。所以本試驗(yàn)選用Sf9來對(duì)中華蜜蜂氣味受體進(jìn)行異源細(xì)胞功能研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組在中華蜜蜂（Apis cerana cerana）中克隆并鑒定出一個(gè)共受體基因AcerOr2和一個(gè)傳統(tǒng)的氣味受體基因AcerOr1[14]。隨后發(fā)現(xiàn)AcerOr1在工蜂和雄蜂不同發(fā)育階段的觸角中均有表達(dá)[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過將中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1與昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIB/V5-His重組，導(dǎo)入草地夜蛾（Spodoptera frugperda）卵巢細(xì)胞系Sf9細(xì)胞，并通過Western blot和免疫熒光檢測AcerOr1在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及定位，以期利用體外異源表達(dá)的細(xì)胞對(duì)其功能進(jìn)行分析驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試細(xì)胞、載體 草地夜蛾卵巢細(xì)胞（Spodoptera frugiperdacell，Sf9）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）（武漢大學(xué)）；感受態(tài)細(xì)胞Top 10購自鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心（北京）；昆蟲表達(dá)載體pIB/V5-His購自華越洋生物（北京）。

1.1.2 主要試劑 無內(nèi)毒素（EndoFree）質(zhì)粒中提、小提試劑盒，凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）購自康為世紀(jì)（北京）； Cellfectin?II Reagent購自Invitrogen（美國）；Sf900 III SFM 培養(yǎng)基和FBS胎牛血清購自Gibco（美國）；青鏈霉素雙抗、DMSO購 自 Boster（武 漢 ）。 山 羊 抗 兔 Alexa Fluor?488、Fluo4-AM、DAPI購自碧云天（上海）；一步法昆蟲細(xì)胞活性蛋白提取試劑盒購自生工（上海）；羊抗兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、驢抗兔IgGHRP二抗購自博士德（武漢）。AcerOr1多克隆抗體由京成天脈生物技術(shù)有限公司（北京）合成。其他試劑為進(jìn)口分裝AR級(jí)或國產(chǎn)AR級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用在線網(wǎng)站http://linux1.softberry.com/all.htm對(duì)AcerOr1蛋白結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2AcerOr1基因的克隆 根據(jù)NCBI中AcerOr1（JN792580）序列設(shè)計(jì)并擴(kuò)增CDS區(qū)，插入到pIB/V5-His質(zhì)粒載體的BamHI和EcoRI位點(diǎn)（下劃線部分），用 Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI保護(hù)堿基（下劃線）的中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOr1的下游引物，引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系為：5×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）2 μL，上下游引物（0.1 μmol·L-1each）各0.8 μL，模板 cDNA2 μL，TaqDNA 酶0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃4 min，94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，72℃7 min，35 個(gè)循環(huán)。

1.2.3AcerOr1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，試劑盒回收pIB/V5-His載體及PCR目的片段，經(jīng)T4DNA連接酶4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，鋪Amp+平板后經(jīng)過夜培養(yǎng)，挑取10個(gè)單菌落，振蕩過夜培養(yǎng)12～16 h后提取質(zhì)粒 DNA，酶切鑒定及測序鑒定，鑒定成功的質(zhì)粒命名為pIB/V5-AcerOr1。

表1 CDS區(qū)擴(kuò)增所用引物Table1 Primer for CDS sequencing

1.2.4 重組質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Cellfectin II Reagent說明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，共設(shè)置3組處理：pIB/V5-AcerOr1（試驗(yàn)組）、pIB/V5-His（空質(zhì)粒作為對(duì)照組）以及正常Sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后重組質(zhì)粒的表達(dá)鑒定

（1）細(xì)胞免疫熒光鑒定

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)液，用4℃預(yù)冷的PBS洗2次，每次5 min，4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min。1% BSA室溫封閉1 h，1∶500稀釋的一抗37℃孵育1.5 h或4℃過夜。加入1∶200稀釋的Alexa Fluor?488熒光二抗，室溫避光孵育1 h。DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min，90%甘油封片，在顯微鏡下拍片觀察細(xì)胞。

（2）Western blot檢測

采用一步法昆蟲細(xì)胞活性蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以每孔上樣10 μL進(jìn)行12%SDSPAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1.5 h。一抗 AcerOr1（1∶1 000）4℃過夜，二抗驢抗兔IgG室溫溫育2 h，顯微鏡下拍片觀察。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)Ca2+檢測 收集各組細(xì)胞，用D-Hanks溶液洗滌細(xì)胞3 次，加入 100 μL 5.0 μmol·L-1的 Fluo4-AM鈣指示劑，28℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min后，除去工作液。加入氣味物質(zhì)， 15 min后棄去液體，D-Hanks洗滌細(xì)胞3次。使用全波長多功能酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，根據(jù)公式：計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+。其中[Ca2+]i是細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，Kd是解離常數(shù)（360 nmol·L-1）。F是樣本熒光強(qiáng)度，F(xiàn)max是加入破膜劑Triton X-100（終濃度為1%）后測得的熒光強(qiáng)度比值，F(xiàn)min是加入破膜劑Triton X-100基礎(chǔ)上又加入 EGTA（終濃度為5 mmol·L-1，pH為8.5）測得的熒光強(qiáng)度比值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)（One-way，ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用在線網(wǎng)站http://linux1.softberry.com/all.htm對(duì)AcerOr1蛋白結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖1所示，AcerOr1的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上。

圖1 AcerOr1蛋白結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.1 Predicted subcellular localization of AcerOr1 protein

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIB/V5-AcerOr1，通過RT- PCR鑒定及BamHI和EcoRI酶切分析，擴(kuò)增出預(yù)期大小目的片段AcerOr1（1 507 bp），并且在3 000 bp以上可見pIB/V5-His（3 521 bp）昆蟲表達(dá)載體的目的條帶（圖2）。

圖2 重組表達(dá)載體pIB/V5-AcerOr1的酶切驗(yàn)證Fig.2 Recombinant expression vector pIB/V5-AcerOr1 verified by restriction enzyme digestion

目的質(zhì)粒經(jīng)北京華大基因測序驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期完全一致（圖3），說明昆蟲載體構(gòu)建成功，插入序列正確，可用于后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 重組質(zhì)粒序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Sequence alignments of recombinant plasmid

2.3 免疫熒光檢測

根據(jù)亞細(xì)胞定位分析和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測AcerOr1是表達(dá)在細(xì)胞膜上的7次跨膜蛋白，為確定AcerOr1在體外Sf9細(xì)胞中是否也表達(dá)在細(xì)胞膜上并具有生物學(xué)功能，通過免疫熒光試驗(yàn)對(duì)AcerOr1在Sf9細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖4所示：在轉(zhuǎn)染AcerOr1的細(xì)胞膜上有綠色熒光，表明重組蛋白主要分布在細(xì)胞膜上。

2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步鑒定AcerOr1在異源Sf9細(xì)胞的表達(dá)情況，采用Western blot驗(yàn)證AcerOr1在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)。檢測結(jié)果如圖5所示：空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組結(jié)果顯示無條帶，轉(zhuǎn)染pIB/V5-AcerOr1的細(xì)胞能檢測到AcerOr1目的條帶大小為50 kDa，與預(yù)期融合蛋白大小片段結(jié)果一致。顯示重組質(zhì)粒在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)目的蛋白。

圖4 AcerOr1在Sf9細(xì)胞上的表達(dá)定位（×50）Fig.4 Subcellular localization of AcerOr1 in Sf9 cells （×50）

圖5 Western blot檢測AcerOr1在Sf9細(xì)胞上的表達(dá)Fig.5 Western blot detection of AcerOr1 expression in Sf9

2.5 細(xì)胞內(nèi) Ca2+檢測

圖6 不同花香物質(zhì)（10-6 mol·L-1）感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平的變化Fig.6 Changes of intracellular free Ca2+ levels after different floral substances （10-6 mol·L-1） infected cells

為了測試AcerOr1潛在的功能活性，對(duì)AcerOr1與氣味配體的結(jié)合特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示（圖6），空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pIB/V5-His空載體的對(duì)照細(xì)胞對(duì)所有檢測的氣味都不敏感；轉(zhuǎn)染pIB/V5-AcerOr1的細(xì)胞對(duì)花香物質(zhì)月桂酸（Lauric acid）、亞麻酸（Linolenic acid）、α-松油醇（α-Terpineol）、十一酸（Undecanoic acid）在低濃度10-6mol·L-1刺激時(shí)，均能引起pIB/V5-AcerOr1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Ca2+濃度升高。該結(jié)果說明，異源表達(dá)的中華蜜蜂氣味受體蛋白AcerOr1保持了天然嗅覺受體蛋白所具有的對(duì)花香配體月桂酸（Lauric acid）、亞麻酸（Linolenic acid）、α-松油醇（α-Terpineol）、十一酸（Undecanoic acid）的識(shí)別能力。

3 討論

蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位通常與其功能密切相關(guān)，其在細(xì)胞內(nèi)的位置決定了其能否發(fā)揮活性，同時(shí)也決定了其分子功能的特異性。因此分析其在細(xì)胞中的定位，可以為蛋白的功能研究提供重要的線索。本研究成功構(gòu)建了昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)載體pIB/V5-AcerOr1，免疫熒光結(jié)果顯示AcerOr1在Sf9細(xì)胞質(zhì)膜中的存在。細(xì)胞膜在信息交流、控制物質(zhì)進(jìn)出、細(xì)胞代謝和免疫方面都發(fā)揮著極其重要的作用。蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜行使其功能時(shí)起重要作用。其中受體蛋白具有識(shí)別功能。對(duì)于多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞間以分泌化學(xué)信號(hào)分子進(jìn)行信息交流的通訊方式最為普遍。根據(jù)信號(hào)分子（配體）溶解性可以分為兩類：親脂類（甲狀腺激素和甾類激素，可穿越細(xì)胞膜）和親水類（生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、多數(shù)激素，不可穿越細(xì)胞膜）。識(shí)別這些信號(hào)分子的膜受體蛋白也可分為兩類：細(xì)胞內(nèi)受體（存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中）和細(xì)胞表面受體。受體通過與其配體特異性結(jié)合，可以將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)的化學(xué)或物理信號(hào)，以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的一系列過程，最終表現(xiàn)為某種生物學(xué)效應(yīng)[15]。AcerOr1在Sf9細(xì)胞質(zhì)膜中的存在，一方面表明AcerOr1成功地轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中，另一方面暗示該蛋白可能與胞外信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)的化學(xué)或物理信號(hào)這些過程，為深入研究AcerOr1蛋白功能提供了可行性。

據(jù)報(bào)道Sf9細(xì)胞內(nèi)源性共受體Orco能夠在細(xì)胞膜上與傳統(tǒng)氣味受體形成具有氣味配體門控通道的作用異源二聚體（OrX+Orco heteromeric complex）[16]，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，能引起Ca2+濃度變化。本試驗(yàn)也表明AcerOr1能夠和Sf9內(nèi)源性O(shè)rco在Sf9細(xì)胞膜上形成離子通道，當(dāng)受到低濃度月桂酸（Lauric acid）、亞麻酸（Linolenic acid）、α-松油醇（α-Terpineol）、十一酸（Undecanoic acid）刺激時(shí)，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。

受體對(duì)氣味配體分子的敏感性和選擇性是功能分析中的重要參數(shù)。本研究結(jié)果顯示AcerOr1作為一般的花香受體，能夠識(shí)別包括月桂酸（Lauric acid）、亞麻酸（Linolenic acid）、α-松油醇（α-Terpineol）、十一酸（Undecanoic acid）等花香物質(zhì)，是一個(gè)廣譜受體。相關(guān)的研究也表明某些氣味受體OR能夠與多種結(jié)構(gòu)無關(guān)的氣味結(jié)合，例如，蝗蟲（Locust）LmigOr3能夠廣泛結(jié)合酮類、酯類和雜環(huán)化合物[17]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）HarmOr6可被Z9-16Ald和Z9-14Ald激活，HarmOr16能夠被Z11-16OH和Z9-14Ald激活[18]；歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）OnubOr1、OnubOr3、OnubOr4、OnubOr5能被其信息素成分的異構(gòu)體E11-14:OH和拮抗劑Z9-14:OAc激活[19]；豆稈野螟（Ostrinia scapulalis）OscaOr3對(duì)種內(nèi)和近緣種的性信息素都有反應(yīng)[20]。相比之下，還有一些氣味受體Ors為特異性受體，具有編碼氣味配體的專一性和敏感性，例如，蚊子CquiOr10僅對(duì)甲基吲哚起特異性反應(yīng)[21]；歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）OnubOr6僅識(shí)別Z11-16OAc[19]；豆稈野螟（Ostrinia scapulais）OscaOr1僅對(duì)近緣種Ostrinia latipennis的性信息素成分E11-14OH有反應(yīng)，OscaOr4特異地識(shí)別E11-14OAc[20,22]；意大利蜜蜂AmelOr11在雄蜂中表達(dá)并對(duì)蜂王信息素9-ODA具有高度的特異性[4]；意大利蜜蜂（Apis mellifera）氣味受體Or151在工蜂中高表達(dá)并能結(jié)合花香物質(zhì)芳樟醇，與蜜蜂的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)[23]。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)載體pIB/V5-AcerOr1，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后能在其細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示重組表達(dá)載體能在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示重組表達(dá)載體能在Sf9細(xì)胞質(zhì)膜中定位。AcerOr1是一個(gè)能夠識(shí)別多種氣味分子的廣譜受體。AcerOr1對(duì)不同化合物的識(shí)別能力可能反應(yīng)了蜜蜂在覓食時(shí)對(duì)植物氣味的適應(yīng)。