肖牘清，吳兆紅，譚博，王戈菲

(廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 心胸外科，廣東 廣州 510000)

肺癌是所有惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于缺乏特異性標志物，70%NSCLC診斷時處于晚期，5年生存率不足15%[1-3]。在NSCLC中，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和細胞角蛋白19片段(cytokeratin-19 fragments,CYFRA21-1 )是最敏感的腫瘤標志物[4-5]。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)來源于原發(fā)腫瘤，可評估腫瘤的發(fā)生發(fā)展狀態(tài)，是目前最具潛力的腫瘤標志物之一[6-8]。CTC與CEA均在NSCLC的診斷、分期、治療及預后方面有一定的作用，但由于其敏感性及特異性的問題，二者在臨床中的應用都有一定的局限性[9-10]。研究表明，CYFRA21-1、鱗狀上皮細胞抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC-Ag)及CEA等傳統(tǒng)腫瘤標志物和“液體活檢”[如CTC、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)等]是NSCLC診斷及監(jiān)測的重要指標[11-12]。目前，傳統(tǒng)腫瘤標志物的聯(lián)合檢測在臨床中已有較廣泛的應用[13]，然而它們與CTC、ctDNA等聯(lián)合檢測的臨床應用尚無進一步的研究論證，因此本研究旨在探討NSCLC患者外周血傳統(tǒng)腫瘤標志物CEA和液體活檢CTC聯(lián)合檢測的水平變化及臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象、主要試劑與儀器

1.1.1研究對象 選取2015年1月—2018年12月病理確診NSCLC患者54例作為研究組，男43例、女11例，平均(63.4±1.58)歲，腫瘤分期依據(jù)國際抗癌協(xié)會(union for international cancer control，UICC)提出的臨床分期標準[14]Ⅰ～Ⅱ期19例、Ⅲ期14例及Ⅳ期21例，肺腺癌37例、肺鱗癌17例；選取肺部良性疾病患者21例作為對照組，男13例、女8例，平均(62.7±2.16)歲，肺炎18例和肺結(jié)核3例。本研究納入標準：(1)研究組患者經(jīng)病理首次確診且未行放化療，(2)對照組患者經(jīng)影像學檢查或病理排除惡性病變，(3)所有患者及家屬同意并自愿參加本研究。排除標準：(1)患者診斷尚不明確，(2)患者既往有放化療病史，(3)患者有其他系統(tǒng)腫瘤或肝腎功能不全，(4)患者無法配合采集標本和資料。2組患者年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的審批(2017069)。

1.1.2主要試劑與儀器 人體外周血白細胞去除試劑盒[含磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液、鼠抗人上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)抗體，批號HCDUB51001]和免疫熒光光原位雜交樣品處理試劑盒(含CD45抗體及染色體探針，批號IHIUB51001)購自江蘇萊爾生物醫(yī)藥；全自動電化學免疫發(fā)光儀與配套CEA檢測試劑盒(批號20190917)購自鄭州安圖生物醫(yī)藥。

1.2 方法

1.2.1免疫磁珠法檢測CTC 采用免疫磁珠法[15]分離富集CTC。采集2組患者清晨空腹肘正中靜脈血5 mL，靜置48 h內(nèi)離心5 min，棄上清，加裂解液，混勻細胞，離心，棄上清，再次加入裂解液，重復混勻、離心后去上清；PBS洗滌免疫磁珠微粒，按每人份鼠抗人EPCAM抗體200 μL及10 μL加入前期處理好的樣本中，充分混勻、孵化30 min，再次沖洗、離心5 min，棄上清，加PBS至500 μL與抗體標記的磁珠20 μL反應20 min。免疫熒光原位雜交(immune fluorescence in situ hybridization，imFISH)檢測分析富集后細胞，CD45抗體進行細胞免疫熒光檢測，用8號著絲粒探針進行熒光原位雜交；在熒光顯微鏡下通過雙免疫標記對富集細胞做形態(tài)學分析。將8號染色體異常擴增信號點>2個、CD45陰性的細胞定義為腫瘤細胞；CTC數(shù)量≥2個的研究對象定義為CTC陽性[16]。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測CEA 采集2組患者清晨空腹血液標本3 mL，ELISA法檢測血清CEA水平[17]，采用全自動電化學免疫發(fā)光儀及原裝配套使用試劑盒，嚴格按照說明書檢測患者血清中CEA濃度，血清CEA水平≥5 μg/L定義為CEA陽性[18]。

1.2.3聯(lián)合檢測 CTC與CEA聯(lián)合檢測為并聯(lián)檢測，即有一項檢測指標陽性為聯(lián)合檢測陽性[19-20]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CTC和CEA單獨檢測

研究組患者外周血CTC和CEA的陽性率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者CTC和CEA的陽性率比較[n(%)]Tab.1 Comparison of the positive rates of CTC and CEA between two groups[n(%)]

2.2 ROC曲線結(jié)果

研究組患者ROC曲線結(jié)果顯示，CTCAUC為0.828，95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)為0.723～0.905；CEAAUC為0.738，95%CI為0.622～0.831，CTC與CEA聯(lián)合檢測AUC為0.737，95%CI為0.622～0.832。見圖1。

圖1 研究組CTC、CEA及聯(lián)合檢測的ROC曲線結(jié)果Fig.1 ROC curves of CTC, CEA and combined detection in the research group

2.3 CTC聯(lián)合CEA檢測

研究組患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測的陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.83，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測的陽性率高于研究組Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.214，P<0.05)；研究組Ⅲ～Ⅳ期患者外周血CTC聯(lián)合CEA檢測的陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.460，P<0.05)。見表2。

表2 CTC與CEA聯(lián)合檢測[n(%)]Tab.2 Combined detection of CTC and CEA [n(%)]

2.4 CTC聯(lián)合CEA檢測和單一檢測的比較

研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯(lián)合檢測陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

CTC由Ashworth于1869年首次提出，CTC與NSCLC的診斷、遠處轉(zhuǎn)移及預后具有相關(guān)性[21-22]。

表3 CTC與CEA聯(lián)合檢測和單一檢測的比較[n(%)]Tab.3 Comparison of CTC and CEA combined detection and single detection[n(%)]

CEA為目前為NSCLC中應用最為廣泛的腫瘤標志物之一，連續(xù)監(jiān)測CEA有助于NSCLC的診斷，評估預后和療效[23]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者外周血CTC和CEA單獨檢測陽性率高于對照組(P<0.05)，CEA和CTC單獨檢測可以輔助診斷NSCLC。有研究表明，二者單獨檢測在臨床中的應用有一定的局限性，CTC檢測不僅花費昂貴，而且敏感性較低，CTC在NSCLC中的應用有局限，但在腫瘤生物標志物中，CTC與CEA具有相關(guān)性[24]。

沈茜等[25]的研究結(jié)果顯示，將CTC≥2個/mL外周血或血清癌胚抗原(CEA)水平≥5 μg/L作為NSCLC診斷指標時，敏感度為87.5%(119/136)，特異度為85.9%(128/149)，提示CTC和CEA在NSCLC的診斷中具有重要價值。Zhou等[26]研究也認為CTC與CEA聯(lián)合檢測是在NSCLC中較好的一個預測模型。但目前研究僅分析CTC或CEA單獨檢測的價值，以及CTC與CEA的相關(guān)性，尚未見臨床研究探討聯(lián)合檢測在NSCLC的臨床價值。本研究ROC曲線結(jié)果顯示，研究組患者CTC與CEA聯(lián)合檢測AUC為0.737(95%CI為0.622～0.832)，且CTC聯(lián)合CEA檢測的陽性率高于對照組(P<0.05)，因此CEA和CTC聯(lián)合檢測也可輔助診斷NSCLC。此外，研究組Ⅲ～Ⅳ期患者聯(lián)合檢測的陽性率分別高于對照組和研究組Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，因此提示CTC與CEA聯(lián)合檢測與NSCLC分期密切相關(guān)，晚期NSCLC(Ⅲ～Ⅳ期)患者聯(lián)合檢測的陽性率高于早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者，臨床中可通過聯(lián)合檢測CTC與CEA初步判斷患者分期，評估患者預后，指導治療，提高患者生存質(zhì)量。另外，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC+CEA聯(lián)合檢測陽性率高于對照組(P<0.05)，而研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此，早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者與對照組患者外周血CTC、CEA單獨檢測的陽性率無差異，CTC、CEA單獨檢測不能輔助檢測早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，而早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)患者外周血CTC與CEA聯(lián)合檢測陽性率高于對照組，CTC與CEA聯(lián)合檢測較單一檢測在臨床應用中更具有優(yōu)勢，可以輔助診斷早期NSCLC(Ⅰ～Ⅱ期)，為NSCLC患者早期治療提供依據(jù)，改善NSCLC患者的遠期預后。

在臨床中，因受客觀因素的限制，部分病人無法利用金標準來診斷，若僅依靠臨床表現(xiàn)及單項指標來診斷，則診斷的準確性較低，而通過幾種指標聯(lián)合檢測可提高診斷的準確性[27-28]。CTC、CEA單獨檢測在NSCLC中的臨床研究較為常見[29-30]，而CTC與CEA聯(lián)合檢測在NSCLC中的臨床價值研究較少。Ding等[31]通過回歸分析證實CTC、CEA均為肺腺癌的獨立危險因素，檢測CTC和CEA水平可作為提高肺腺癌診斷率的一種方法。本研究論證了CTC與CEA聯(lián)合檢測在NSCLC早期診斷中的臨床意義，二者聯(lián)合檢測不僅提高了CTC在NSCLC中的應用價值，也為NSCLC高?；颊叩暮Y查提供了一種無創(chuàng)、簡捷的方法。本研究結(jié)果顯示，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血CTC、CEA單獨檢測陽性率與對照組無差異(P>0.05)，研究組Ⅰ～Ⅱ期患者外周血聯(lián)合檢測的陽性率高于對照組(P<0.05)，提示CTC和CEA聯(lián)合檢測在早期NSCLC的診斷中更具有優(yōu)勢。在臨床中，依靠腫瘤標記物單一檢測診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC較困難，通過CTC和CEA聯(lián)合檢測可以輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC，必要時可聯(lián)合影像學結(jié)果共同判斷，可早期發(fā)現(xiàn)NSCLC，早期進行干預，對提高NSCLC患者遠期生存質(zhì)量有重要意義。

本研究存在以下不足，本研究為單中心研究，數(shù)據(jù)的選擇存在一定的偏差；作為回顧性分析，部分患者缺失隨訪資料，未能進一步做預后生存分析；僅初步探討CTC與CEA聯(lián)合檢測在NSCLC患者中的臨床價值，CTC與CEA、CYFRA21-1及NSE等多種傳統(tǒng)腫瘤標志物聯(lián)合檢測在肺癌早期診斷和推測預后的意義則有待進一步論證。

總之，CTC、CEA單獨檢測及CTC聯(lián)合CEA檢測均可輔助診斷NSCLC，CTC聯(lián)合CEA檢測與NSCLC的分期有關(guān)，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)NSCLC患者CTC+CEA聯(lián)合檢測較高，CTC聯(lián)合CEA檢測較單一檢測更有助于輔助診斷早期(Ⅰ～Ⅱ期)NSCLC。對于NSCLC高?；颊?，應聯(lián)合CTC與CEA水平進行評估，早期診斷，明確分期，及早干預，更有利改善患者預后，延長生存期。