李輝，張一嬌，劉津軍，盧靜，孫瑩瑩，李燕燕

(1.邯鄲市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河北 邯鄲 056004； 2.邯鄲市中心醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河北 邯鄲 056004)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷是指短時(shí)間心肌供血不足或中斷一段時(shí)間后重新恢復(fù)供血，在此過程或造成心肌的損傷[1]。既往研究證實(shí)，MI/R可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬、線粒體損傷以及氧自由基的過量產(chǎn)生等[2-3]。線粒體自噬在MI/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，線粒體自噬功能的失調(diào)會誘導(dǎo)大鼠MI/R損傷[4]。因此，通過調(diào)控大鼠MI/R中線粒體自噬對改善心肌功能具有重要意義。輔酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是一種脂溶性醌，廣泛表達(dá)于心臟、腎臟、肝臟及胰等器官[5]。研究發(fā)現(xiàn)，臨床和動物實(shí)驗(yàn)均證明外源性CoQ10可以改善MI/R，對心肌具有一定的保護(hù)作用[6]。CoQ10可以通過抑制氧自由基過量產(chǎn)生以及改善心肌細(xì)胞線粒體ATP生成等途徑保護(hù)MI/R造成的心肌組織損傷[7]，但目前有關(guān)CoQ10對MI/R的分子作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究擬通過構(gòu)建MI/R大鼠模型，探究CoQ10對MI/R的分子作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 60只無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)級6～8周雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部[SCXK(京)2018-0010]。大鼠置于室溫(25 ℃)、相對濕度70%環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2主要藥品與試劑 CoQ10(國藥準(zhǔn)字H46020107，海南卓泰)，乳酸脫氫酶試劑盒、肌酸激酶、Western blot一抗及二抗稀釋液(北京中杉金橋)，心肌肌鈣蛋白Ⅰ(上海研輝)，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE )試劑盒、Beclin-1一抗(Coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein，Beclin-1)及細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ抗體(cytochrome c oxidase Ⅳ antibody，COX Ⅳ)一抗(江蘇碧云天)，自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule associated protein light chain 3，LC3)一抗和p62一抗(美國CST公司)。

1.1.3主要儀器 小動物呼吸機(jī)(湖南湘儀，SAR-1000)，高速離心機(jī)(美國Thermo Scientific，H1850)，細(xì)胞渦旋儀(武漢維塞爾，H22539)，-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾，DW-86L578J)，4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱，F(xiàn)YL-YS-128)，脫色搖床(江蘇盛藍(lán)，H22820)，多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo賽默飛世爾，SuPerMax-3100)，高速臺式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀，SKFH-1600RW)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯，NIB900-FL)，Western blot檢測裝置(美國Bio-Rad，125-0098)，高純水機(jī)(美國Millipore，CSB-20L)。

1.2 方法

1.2.1建模、分組及心率測量 60只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組(sham組)、假手術(shù)+CoQ10組(CoQ10組)、模型組(Model組)及模型+CoQ10組(Model+CoQ10組)，每組15只；采用戊巴比妥鈉(75 mg/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定，大鼠心電肢體導(dǎo)聯(lián)和呼吸機(jī)連接，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖；開胸暴露心臟分離左側(cè)冠狀動脈，sham組和CoQ10組大鼠左冠狀動脈前降支只穿線不結(jié)扎；Model組和Model+CoQ10組大鼠結(jié)扎左冠狀動脈前降支約40 min，后松開結(jié)扎線再灌注2 h(以缺血時(shí)心肌組織變白，心電圖ST段抬高，再灌注時(shí)心肌變紅且ST段下降視為造模成功[8])；CoQ10組和Model+CoQ10組大鼠肌肉注射CoQ10[10 mg/(kg·d)]，sham組和Model組注射等量的生理鹽水。記錄第7天各組大鼠心率，然后抽取各組大鼠血液并麻醉后處死，手術(shù)剪打開大鼠胸腔，剪下心臟組織并放置于液氮罐內(nèi)保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2檢測血清乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)含量 取各組大鼠血液5 mL置于抗凝離心管，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，并按照各試劑盒操作說明書檢測大鼠血清中LDH、CK和cTnI含量。

1.2.3氯代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法檢測大鼠心肌梗死面積 取各組大鼠垂直心臟長軸，順心尖向底部切片；心尖組織切片置于37 ℃、pH 7.4的TTC溶液中染色10 min，4%多聚甲醛固定；觀察并計(jì)算心肌梗死面積比例[心肌梗死面積=缺血心肌組織(白色區(qū)域)面積/正常心肌(紅色區(qū)域)面積][9]。

1.2.4HE染色 取各組大鼠心尖組織，4%多聚甲醛固定，不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，依據(jù)HE染色試劑盒進(jìn)行HE染色操作，觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5Western blot 檢測大鼠心肌組織COX IV、Beclin-1、p62及LC3蛋白 取各組大鼠心尖組織，PBS潤洗1～2次，離心，心肌碾磨體積 ∶細(xì)胞組織裂解液體積為1 ∶5，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；80 V凝膠電泳30 min，轉(zhuǎn)120 V、60 min至溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層，依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)長2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對應(yīng)一抗COX Ⅳ(1 ∶1 000)、Beclin-1一抗(1 ∶500)、p62一抗(1 ∶1 000)和LC3(1 ∶1 000)4 ℃過夜，按照1 ∶5 000稀釋比例，室溫孵育對應(yīng)的鼠二抗和兔二抗1 h；搖床搖晃加TPBS洗滌3次，5 min/次，加顯影液顯影并拍照，顯影結(jié)果以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.6電鏡觀察大鼠心肌線粒體形態(tài)及自噬小體 將各組大鼠包埋的心尖組織采用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度100 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬鉛染色，透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體形態(tài)以及自噬小體并對其拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌功能

sham組與CoQ10組大鼠血清LDH、CK、cTnI、心肌梗死面積及心率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與sham組相比較，Model組大鼠血清LDH、CK、cTnI及心肌梗死面積均值均明顯增加，但心率均值明顯降低(P<0.01)；與Model組比較，Model+CoQ10組大鼠血清LDH、CK、cTnI及心肌梗死面積均值均降低，但心率均值升高(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2 心肌組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，與sham組相比，CoQ10組大鼠心肌組織無明顯的病理學(xué)改變，Model組大鼠心肌組織呈病理學(xué)改變，心肌纖維排列不規(guī)則，有明顯的水腫現(xiàn)象，心肌組織間隙變大等；與Model組相比，Mode+CoQ10組大鼠心肌組織損傷得到明顯的改善，心肌纖維排列相對規(guī)則，水腫現(xiàn)象減輕。見圖1。

表1 各組大鼠血清酶、心肌梗死面積及心率比較Tab.1 Effect of CoQ10 on myocardial function in each

圖1 各組大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)Fig.1 Morphological changes of myocardial tissue in each group(HE，×200)

2.3 大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，CoQ10組大鼠心肌組織線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)無顯著性影響，Model組大鼠心肌組織COX Ⅳ、Beclin-1及LC3蛋白表達(dá)均上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與Model組相比較，Model+CoQ10組大鼠心肌組織COX Ⅳ、Beclin-1和LC3蛋白表達(dá)下調(diào)，p62蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與sham組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與Model組相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01。圖2 各組大鼠心肌組織線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.2 Effect of CoQ10 on the expression of mitochondrial autophagy-related proteins in each group(Western blot)

2.4 線粒體自噬的形態(tài)學(xué)變化

透射電鏡結(jié)果顯示，與sham組相比，CoQ10組大鼠心肌組織線粒體形態(tài)學(xué)及自噬小體數(shù)量無明顯改變，Model組大鼠線粒體內(nèi)自噬小體數(shù)目則顯著增加；與Model組相比，Model+CoQ10組大鼠心肌組織線粒體內(nèi)自噬小體數(shù)目減少。見圖3。

3 討論

冠心病心肌梗死是一種嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病，如何有效的防治冠心病心肌梗死是目前醫(yī)學(xué)界迫切需要解決的難題[10]。MI/R是指機(jī)體組織或器官經(jīng)過一段時(shí)間的缺血缺氧之后恢復(fù)血流再灌注，組織或器官沒有好轉(zhuǎn)反而加重的情況[11]。線體損傷是MI/R中的一種重要表現(xiàn)[12]。心肌細(xì)胞的正常功能維持需要消耗大量的ATP，機(jī)體中的線粒體則是心肌細(xì)胞中含量最高的細(xì)胞器[13]。研究表明，在I/R或者心肌細(xì)胞H/R時(shí)均會導(dǎo)致線粒體功能的障礙，如活性氧的生成增多，線粒體膜電位的除極化以及通透性轉(zhuǎn)換孔的開放等[14]。損傷的細(xì)胞器需及時(shí)被清理以保證機(jī)體的正常生命活動，但在線粒體功能障礙時(shí)會誘發(fā)自噬的激活或抑制[15-18]。因此，通過尋找有效藥物治療MI/R誘發(fā)的線粒體功能障礙至關(guān)重要。

注：箭頭表示線粒體自噬。圖3 各組大鼠心肌組織線粒體的形態(tài)學(xué)變化及自噬小體數(shù)量(400×)Fig.3 Transmission electron microscope observation of mitochondrial morphological changes and the number of autophagosomes in each group(400×)

CoQ10是一種脂溶性抗氧化劑，能夠通過清除自由基，降低機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。目前CoQ10被廣泛用于心肌病、心肌炎、心力衰竭等疾病的治療，也被廣泛應(yīng)用于生殖領(lǐng)域，其抗氧化作用可顯著改善患者卵巢功能，提高輔助生殖助孕成功率[20-21]。在高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中，CoQ10能夠有效降低細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[22]。CoQ10能夠通過抑制氧化應(yīng)激，改善細(xì)胞線粒體功能障礙[23]。在血吸蟲誘導(dǎo)的肝臟損傷中，CoQ10能夠有效治療血吸蟲誘發(fā)的肝損傷，其機(jī)制涉及降低肝臟氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體功能[24]。CoQ10能夠降低大鼠黑質(zhì)細(xì)胞凋亡，改善PD大鼠黑質(zhì)細(xì)胞損傷[25]。以上研究均表明，CoQ10能夠有效通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激，改善線粒體功能，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體和組織免受損傷。但是，目前有關(guān)CoQ10對大鼠MI/R的保護(hù)作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠MI/R模型，探究CoQ10的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，缺血45 min再灌注2 h后，Model組大鼠血清LDH、CK及cTnI含量明顯增加，梗死面積增大，心率降低；給予CoQ10注射后可以降低LDH、CK及cTnI含量，降低梗死面積，升高心率，這些表明CoQ10能夠改善MI/R心肌損傷。HE染色結(jié)果顯示，Model組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌組織出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，心肌間隙變大；Model+CoQ10組大鼠心肌組織損傷得到改善，心肌纖維排列相對規(guī)則。為進(jìn)一步探究CoQ10對IM/R的作用，本研究采用Western blot檢測了線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示Model組大鼠心肌組織COXI、COX IV及LC3升高，p62降低；肌肉注射CoQ10可以顯著抑制上述相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，改善心肌功能。在通過投射電鏡觀察心肌線粒體結(jié)構(gòu)以及自噬小體數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，Model組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，自噬小體數(shù)量增多；與Model組相比，Model+CoQ10組大鼠線粒體膜結(jié)構(gòu)有所改善，功能得到改善，自噬小體數(shù)量減少。

綜上所述，CoQ10可能通過調(diào)控線粒體自噬進(jìn)而保護(hù)MI/R心肌損傷。后續(xù)為更加深入的認(rèn)識CoQ10對線粒體自噬的調(diào)控分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究，可通過體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，探討CoQ10是通過作用何種靶分子調(diào)控線粒體自噬，進(jìn)而為CoQ10治療IM/R提供理論基礎(chǔ)。