張玥，陳林，謝春，楊小雪，羅俊，羅喜榮

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程研究中心 & 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025； 3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 藥理學(xué)教研室，貴州 都勻 558013； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，貴州 貴陽 550025； 5.黔東南州疾病預(yù)防控制中心，貴州 凱里 556000； 6.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

砷是廣泛存在于環(huán)境中的有毒致癌金屬元素[1]，近幾十年，慢性砷暴露人群急劇增多[2-3]。長期砷暴露可致多系統(tǒng)損害[4]，砷主要蓄積在皮膚及肝臟，通過血腦屏障進(jìn)入腦組織的砷很少，因此多年來對砷致中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響研究較少。砷中毒可以引起腦組織氧化損傷[5]、腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶紊亂[6]及腦中海馬組織病理學(xué)變化[7]等損害。已有研究證實(shí)，砷中毒可以導(dǎo)致膽堿能系統(tǒng)的破壞[8]。因此改善砷中毒引起的海馬組織病理學(xué)變化及保護(hù)中樞膽堿能系統(tǒng)功能可能是治療砷中毒的有效措施。靈芝三萜類化合物(Ganodermalucidumtriterpenoids，GLT)具有廣泛藥理活性，如抗腫瘤、保肝排毒、抗HIV病毒以及降低膽固醇等作用[9-11]，作者所在課題組前期研究證實(shí)GLT對AD大鼠模型海馬組織病理學(xué)病變有一定的調(diào)節(jié)保護(hù)作用[12]，并可調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)的平衡[13]。因此，本研究采用高、中、低3種濃度的GLT處理砷中毒模型動(dòng)物，觀察處理后模型動(dòng)物海馬組織形態(tài)學(xué)變化及GLT對模型大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性變化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

亞砷酸鈉(NaAsO2)購自Sigma公司，GLT由中國科學(xué)院地球化學(xué)研究所超臨界流體技術(shù)研究中心提取(GLT溶液用金龍魚食用油溶解配制)，HE染色液購自北京Solarbio公司，4%多聚甲醛購自美國Bio-World公司，AChE試劑盒和ChAT試劑盒購買于南京建成生物工程有限公司。DMi 1倒置顯微鏡(德國Leica公司)、Microfuge ?20R冷凍離心機(jī)(美國Beckman coulter公司)、WP-UP-11-20超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠60只(貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，批準(zhǔn)號1503145)，體質(zhì)量為(100±20)g，飼養(yǎng)于自然晝夜交替環(huán)境，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為5組，每組12只，雌雄各半，分為正常對照組(生理鹽水，10 mL/kg)、模型組(NaAsO210 mL/kg)、GLT低劑量組(GLT 0.25 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT中劑量組(GLT 0.50 g/kg+NaAsO210 mg/kg)、GLT高劑量組(GLT 1.00 g/kg+NaAsO210 mg/kg)，按上述各組給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥90 d。按照40 mg/100 g的麻醉劑量依組別把大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，并迅速斷頭處死，取出大腦以矢狀面為界均分大腦為兩半，其中一半腦組織，取視交叉后 5 mm厚的矢狀位腦片(包含海馬)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1腦組織中AChE、ChAT活性檢測 每1 g腦組織中加入預(yù)冰的生理鹽水9 mL，用勻漿器制備勻漿，離心備用。按照光化學(xué)法試劑盒提供方法步驟測定AChE，ChAT活性。

1.3.2海馬蘇木精-伊紅(HE)染色觀察 將分離出來的海馬組織放入對應(yīng)組別的小皿中(小皿中提前加入預(yù)冷的4%多聚甲醛磷酸緩沖鹽溶液)固定過夜，使用70%、85%及100%酒精進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明20 min，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，封片拍照。

1.3.3海馬電鏡切片觀察 取出的海馬組織經(jīng)2.5%戊二醛固定2 h后，磷酸緩沖液清洗3次，1%鋨酸固定1 h，70%、85%及100%丙酮分別脫水10 min，環(huán)氧丙烷浸透，環(huán)氧樹脂包埋，聚合后超薄切片機(jī)切片，最后進(jìn)行透射電鏡攝片觀察記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織勻漿中AChE、ChAT的表達(dá)

與正常對照組相比，模型組中AChE活力明顯升高，ChAT活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予GLT干預(yù)后，與模型組相比，AChE活力明顯降低，ChAT活力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 GLT對大鼠腦組織AChE和ChAT活力的影響Tab.1 Effects of GLT on the AChE and ChAT activity in the brain of

2.2 大鼠海馬組織HE染色結(jié)果

海馬組織HE染色結(jié)果顯示，正常對照組海馬組織細(xì)胞數(shù)量多，形態(tài)完整，排列有序；而模型組海馬組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列重度紊亂，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變性部分腦組織出血；GLT低劑量組海馬組織細(xì)胞數(shù)量與模型組相比，明顯增多，細(xì)胞出現(xiàn)輕度紊亂；GLT中、高劑量組海馬組織細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞形態(tài)趨近于正常對照組細(xì)胞。見圖1。

正常對照組 模型組 GLT低劑量組 GLT中劑量組 GLT高劑量組圖1 大鼠海馬組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of hippocampus in rats(40×)

2.3 大鼠海馬組織電鏡觀察

正常對照組海馬組織細(xì)胞完整，核膜連續(xù)，細(xì)胞器豐富；而模型組海馬組織細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核膜不連續(xù)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少，線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞嚴(yán)重；當(dāng)給予GLT干預(yù)后，細(xì)胞水腫明顯減輕，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞及線粒體腫脹得以明顯改善。見圖3。

正常對照組(4 000×) 模型組(7 000×) GLT中劑量組(4 000×) GLT高劑量組(5 000×) 圖2 大鼠海馬組織透射電鏡觀察Fig.2 The transmission electron microscope examination of hippocampus in rats

3 討論

砷中毒已經(jīng)成為世界上的一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，特別是在孟加拉國、印度、中國和日本[14-15]。然而，全世界估計(jì)有1億人通過飲用水接觸過量的砷引起中毒，并且砷中毒幾乎影響機(jī)體的每個(gè)器官系統(tǒng)，包括大腦。在許多流行病學(xué)研究中，砷中毒已被證明會(huì)增加神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的發(fā)生[16-17]。據(jù)報(bào)道，砷能夠穿過血腦屏障，影響基底神經(jīng)節(jié)，海馬及大腦皮層受損[18]。大腦作為機(jī)體中最重要器官之一，大腦中的海馬組織是機(jī)體進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知等高級神經(jīng)活動(dòng)的重要區(qū)域[19]，當(dāng)其受到砷中毒引起的病理學(xué)病變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂等一系列健康問題[20]。然而在本研究中發(fā)現(xiàn)在NaAsO2引起的砷中毒大鼠模型中，模型組大鼠海馬組織發(fā)生嚴(yán)重病理學(xué)病變，如神經(jīng)元變性、部分海馬組織出血、海馬組織結(jié)構(gòu)排列紊亂以及膠質(zhì)細(xì)胞增生。當(dāng)給予GLT干預(yù)后，能夠逆轉(zhuǎn)砷中毒導(dǎo)致的海馬組織的病理學(xué)病變，表明GLT能夠?qū)ι橹卸疽鸬拇笫蠛ｑR組織的病理學(xué)病變有一定的保護(hù)作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，砷中毒后AChE活性升高[21]。另一項(xiàng)研究表明，AChE活性隨著大鼠砷濃度的增加而活性升高[22]。這些報(bào)道均證實(shí)了砷中毒可以引起膽堿能功能異常。然而，在本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠中AChE活力明顯升高，ChAT活力明顯降低，當(dāng)給予GLT干預(yù)后，能夠顯著抑制砷中毒引起的AChE活力升高，ChAT活力降低。

綜上所述，砷中毒可以引起大鼠海馬組織病理學(xué)病變的發(fā)生及膽堿能功能異常升高，GLT能夠逆轉(zhuǎn)砷中毒可以引起大鼠海馬組織病理學(xué)病變及改善膽堿能功能，靈芝三萜類化合物GLT可能將會(huì)成為一個(gè)治療砷中毒的潛在藥物。