韓晶，洪艷**，王琪，檀夢天

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025； 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 科教處，河北 邯鄲 056038)

Ⅰ型糖尿病由于胰島素分泌缺陷或(和)胰島損傷可引起高血糖，目前的治療手段為長期依賴藥物或胰島素替代治療，但隨著病程的發(fā)展及伴隨的多種并發(fā)癥，該病具有很高的致殘及致死率。不同來源的干細(xì)胞以及胰島前體細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后分化為胰島素分泌細(xì)胞再移植的方法是Ⅰ型糖尿病最理想的治療方式[1]，而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells , hUMSCs)具有來源廣泛、較低免疫原性、易于分離培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2-5]。Notch信號通路是影響細(xì)胞命運(yùn)的經(jīng)典通路之一，在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中主要調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及凋亡等[6]。神經(jīng)元素3(neurogenin-3，Ngn3)是一種螺旋狀的轉(zhuǎn)錄因子，專一性表達(dá)于胰島前體細(xì)胞[7]，Ngn3的缺失突變會導(dǎo)致新生兒糖尿病，并阻止胰島β細(xì)胞從人類多能干細(xì)胞分化[8]。目前對誘導(dǎo)hUMSCs體外分化過程中Notch信號通路與Ngn3表達(dá)的關(guān)系報道較少，本研究采用分階段聯(lián)合誘導(dǎo)法(前10 d用含EGF的低糖培養(yǎng)基，后11 d用含激活素A和尼克酰胺的高糖培養(yǎng)基)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hUMSCs向胰島前體細(xì)胞分化，檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞中Notchl、胰島前體細(xì)胞標(biāo)記物Ngn3的變化，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 臍帶來源于健康足月剖宮產(chǎn)手術(shù)，由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及貴陽市花溪區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科提供，家屬知情同意。產(chǎn)婦經(jīng)檢查無艾滋病、乙型肝炎病毒、梅毒、螺旋體、支原體等傳染病原體感染情況，血糖血壓均在正常范圍內(nèi)。

1.1.2試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(Solarbio公司，美國)，0.25% 胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)，胎牛血清FBS(Gibco公司，澳大利亞)，γ分泌酶抑制劑(DAPT，亦瑞生物技術(shù)有限公司，上海)，鼠抗人CD105單克隆抗體，兔抗人CD34、CD45單克隆抗體(博士德公司，武漢)、兔抗人Ngn3(Abcam公司，美國)，兔抗人Notch1、兔抗人Pdx1單克隆抗體(Epitomics公司，美國)，兔抗人胰高血糖素(Glucagon，Watpa公司，新西蘭)，單克隆抗體β-actin抗體(Abmart公司，美國)，內(nèi)皮生長因子(EGF)、激活素A (Pepro Tech公司，美國)，尼克酰胺(Sigma公司，美國)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgA(百奧萊博科技有限公司，北京)，倒置相差顯微鏡(C-SHG, Nikon公司，日本)，電子顯微鏡HITACHI7650(日立公司，日本)，Bio-Rad伯樂梯度PCR儀(伯樂Bio-rad公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1hUMSCs分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo) 取健康足月剖宮產(chǎn)術(shù)后臍帶，長度約為5～10 cm、直徑約為1～2 cm，高壓滅菌的PBS溶液內(nèi)放置，4 ℃保存，4 h內(nèi)使用；用PBS清洗干凈后在超凈工作臺中剪成1～2 cm，剝離臍動脈，分離臍靜脈內(nèi)皮；分離組織、剪碎至1 mm3大小，加入含有20% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基，浸泡1～2 min；使用眼科鑷將其轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中成陣列分布，各組織塊間間隔在5～6 mm，倒置放入37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，2 h后取出；加入含有20% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，此后每隔1 d加入20% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基1 mL，加至5 mL時停止。隔日觀察，有長梭形細(xì)胞遷移出組織塊時換液，傳至第3～5代，采用分階段聯(lián)合誘導(dǎo)法誘導(dǎo)：前10 d采用低糖培養(yǎng)基(含10% FBS、5.5 mmol/L葡萄糖、20 μg/L EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，每隔2 d換液；誘導(dǎo)培養(yǎng)至第11天時采用高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、25 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L尼克酰胺、10 μg/L激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，每隔2 d換液，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第21天。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 單獨(dú)培養(yǎng)的hUMSCs作為空白對照組，加入誘導(dǎo)因子后培養(yǎng)至第7天、第14天及第21天的hUMSCs分別作為誘導(dǎo)第7天組、第14天組及第21天組。另取P5代hUMSCs作為阻斷組，按照上述分階段聯(lián)合誘導(dǎo)法誘導(dǎo)，全程在培養(yǎng)基中加入γ分泌酶抑制劑(用DMSO溶解，終濃度為5 μmol/L)，至第21天完成阻斷誘導(dǎo)。

1.2.3hUMSCs鑒定 取P5代hUMSCs以1×104密度接種在載玻片上，接種后第3天觀察并取貼壁較好的細(xì)胞爬片，PBS洗滌、4% 多聚甲醛固定、0.3% TritonX-100 破膜、3% 過氧化氫和山羊血清(1 ∶100)分別封閉20 min；按照試劑說明書，分別加一抗CD105、CD34、CD45(1 ∶100)，4 ℃濕盒孵育過夜；PBS洗滌3次，加免疫組化檢測試劑(PV-6001/ PV-6002)；DAB顯色，倒置相差顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4hUMSCs誘導(dǎo)的胰島前體細(xì)胞鑒定 取誘導(dǎo)第21天組和空白對照組細(xì)胞，以1×104密度接種在載玻片上，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，分別加入一抗Ngn3(1 ∶100)、Pdx1(1 ∶100)、Glucagon(1 ∶4 000)孵育，其余操作步驟與1.2.3相同，顯色后在倒置相差顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.5電鏡觀察誘導(dǎo)后胰島前體細(xì)胞 取誘導(dǎo)第21天組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(數(shù)量為2×104)，收集，沖洗，離心沉淀，預(yù)冷2.5% 戊二醛4 ℃固定24 h；1% 鋨酸固定1 h；丙酮梯度脫水各15 min；Epon812滲透聚合包埋；修塊、切片60 nm厚；輕醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，電子顯微鏡HITACHI7650觀察并采集圖像。

1.2.6Ngn3和Notch1的表達(dá) 取誘導(dǎo)hUMSCs過程中誘導(dǎo)各組和空白對照組細(xì)胞，以1×104密度接種在載玻片上，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，分別加一抗Ngn3(1 ∶100)和Notch1(1 ∶400)，其余操作步驟與1.2.3相同，顯色后在倒置相差顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7Ngn3、Notch1及GlucagonmRNA表達(dá) 分別取誘導(dǎo)第7天、第14天、第21天組hUMSCs，PBS洗滌3次后加入Trizol等試劑提取細(xì)胞總RNA，步驟參照試劑盒說明書；選取20 μL作為反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用上海生工公司提供的PCR引物，采用Bio-Rad伯樂梯度PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，目的基因引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8Ngn3、Notch1蛋白表達(dá) 收集P5代及在誘導(dǎo)第7天、第14天、第21天組、空白對照組及阻斷組的hUMSCs，冰上裂解(裂解液PMSF ∶RIPA=1 ∶100)；收集細(xì)胞，離心后取上清，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度；各組蛋白上清加入5× 蛋白上樣緩沖液加熱變性后加至SDS-PAGE凝膠中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后，分別用對應(yīng)一抗Ngn3(1 ∶500)、Notch1(1 ∶1 000)、內(nèi)參蛋白兔抗人β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，轉(zhuǎn)PVDF膜3次。加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgA(1 ∶20 000)，室溫孵育1.5 h，再次TBS-T洗膜3次；化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)拍照，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS Statistics 20.0建立數(shù)據(jù)庫，符合參數(shù)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)，用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；不符合參數(shù)檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)變量變換后仍不符合，采用秩和檢驗(yàn)；P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUMSCs分離與培養(yǎng)

取健康足月剖宮產(chǎn)兒臍帶(圖1A)，剪碎后平鋪于培養(yǎng)瓶底(圖1B)，連續(xù)培養(yǎng)10 d后觀察，原代hUMSCs從組織塊中遷移出，貼壁生長(圖1C)，消化傳代至P5代，細(xì)胞生長穩(wěn)定，呈長梭形，漩渦狀生長(圖1D)。

2.2 hUMSCs表面標(biāo)記分子的鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示hUMSCs表達(dá)CD105，細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色(圖2A)； CD34、CD45呈陰性表達(dá)，細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)無明顯棕黃色(圖2B、2C)；空白對照組細(xì)胞未著色(圖2D)。

2.3 胰島前體細(xì)胞的鑒定

誘導(dǎo)第21天組hUMSCs內(nèi)Ngn3(圖3A)、Pdx1(圖3B)、Glucagon(圖3C)免疫組化染色呈陽性，空白對照組未見著色(圖3D)。透射電鏡觀察胰島前體細(xì)胞，可見細(xì)胞核大，形狀不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)較稀疏，未見核仁，胞質(zhì)內(nèi)含有許多染色深淺不一的分泌顆粒，細(xì)胞器豐富(圖4A)；圖4B中可見 hUMSCs細(xì)胞核大，核內(nèi)染色質(zhì)較稀疏，可見2個明顯的核仁，核質(zhì)比大，細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)量少，未見分泌顆粒，細(xì)胞器較少。

注：A為足月產(chǎn)兒臍帶，B為組織塊植入培養(yǎng)瓶，C為P0代細(xì)胞第10天，D為P5代細(xì)胞第3天。圖1 分離與培養(yǎng)hUMSCsFig.1 Isolation and culture of hUMSCs

注：A為 CD105細(xì)胞，B為CD34細(xì)胞，C為 CD45細(xì)胞，D為空白對照。圖2 hUMSCs表面標(biāo)記分子鑒定(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×100)Fig.2 Identification of hUMSC surface markers (Immunohistochemical staining,×100)

注：A為Ngn3免疫陽性細(xì)胞，B為Pdx1免疫陽性細(xì)胞，C為Glucagon免疫陽性細(xì)胞，D為空白對照組。圖3 胰島前體細(xì)胞鑒定(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×100)Fig.3 Identification of islet progenitor cells(Immunohistochemical staining,×100)

注：A為胰島前體細(xì)胞(×32 000)，B為hUMSCs(×48 000)，N為細(xì)胞核，G為分泌顆粒。圖4 胰島前體細(xì)胞透射電鏡觀察 Fig.4 Images of islet progenitor cells and hUMSCs under transmission electron microscope

2.4 hUMSCs向胰島前體細(xì)胞誘導(dǎo)過程中的Notch1與Ngn3表達(dá)

誘導(dǎo)后可見hUMSCs呈多邊形，胞體較寬大，核大，卵圓形，核仁明顯。誘導(dǎo)第7天(圖5A)、第14天(圖5B)、第21天(圖5C)Ngn3免疫陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，空白對照組著色淺淡(圖5D)。Notch1表達(dá)如圖6所示，Notch1免疫陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，第7天(圖6A)、第14天(圖6B)表達(dá)增多，著色逐漸深染，第21天(圖6C)較第14天表達(dá)減少，空白對照組較各誘導(dǎo)組細(xì)胞著色淺(圖6D)。

注：A、B、C分別為hUMSCs誘導(dǎo)第7、14及21天，D為空白對照組。圖5 各組hUMSCs中Ngn3表達(dá) (×100)Fig.5 The effect of induction on Ngn3 expression (×100)

2.5 Ngn3、Notch1及Glucagon mRNA表達(dá)

與對照組比較，第14天組Ngn3，第7、14及21天組的Notch1，第14及21天組GlucagonmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；誘導(dǎo)過程中Ngn3表達(dá)量在第14天時達(dá)到峰值，第21天降低；Notch1表達(dá)在第7天時最高，隨后下降；空白對照組表達(dá)量較低。誘導(dǎo)各組的Glucagon表達(dá)于第7天升高，第14天及第21天降低。見圖7。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖7 各組hUMSCs中Ngn3、Notch1及Glucagon mRNA表達(dá)Fig.7 The effect of induction on the mRNA levels of Ngn3, Notch1 and Glucagon in each group

2.6 Ngn3與Notch1蛋白表達(dá)

Ngn3蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間延長而逐漸增高(P<0.01),第14天表達(dá)最高，第21天減少；Notch1蛋白表達(dá)量在第7天最高，之后隨誘導(dǎo)時間延長而逐漸減少，第21天最少(圖8)。阻斷組Ngn3蛋白表達(dá)減少，與誘導(dǎo)第21天組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，誘導(dǎo)第21天組Notch1蛋白表達(dá)灰度值與阻斷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖9。

3 討論

人類間充質(zhì)干細(xì)胞是一類被廣泛研究的成體干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)中具有巨大潛力[9]。本實(shí)驗(yàn)選用hUCMSCs 作為種子細(xì)胞，細(xì)胞從臍帶組織分離后培養(yǎng)，陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子 CD105 , 陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面分子CD34 和CD45，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特征。前期研究[10]和本實(shí)驗(yàn)利用分階段聯(lián)合誘導(dǎo)法誘導(dǎo) hUCMSCs 向胰腺前體細(xì)胞分化，先在低糖環(huán)境作為基礎(chǔ)培養(yǎng)，再經(jīng)過高糖培養(yǎng)基中高糖刺激，有利于以Pdx1 陽性表達(dá)為特征的胰腺祖細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化[11-12]。Notch信號通路是影響干細(xì)胞增殖分化過程中細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵通路之一。哺乳動物有4種Notch受體和5種Notch配體，其中Notch1受體表達(dá)相對穩(wěn)定[13]。在正常發(fā)育的胰腺中，激活Notch信號可阻止胰腺前體細(xì)胞分化，分化完全的內(nèi)分泌腺會失去對Notch信號的應(yīng)答[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，誘導(dǎo)hUMSCs分化至第7天有胰島前體細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞表達(dá)高水平Glucagon，隨誘導(dǎo)時間延長，Notch1受體表達(dá)減少，Glucagon水平下降；誘導(dǎo)至第21天時，電鏡觀察到胞體內(nèi)出現(xiàn)分泌顆粒，以上變化提示胰島前體細(xì)胞可能進(jìn)一步分化各種胰島內(nèi)分泌細(xì)胞。研究表明，小鼠胰腺發(fā)育早期，Glucagon分泌細(xì)胞發(fā)育較早，并可能短暫分泌胰島素，Glucagon分泌細(xì)胞與胰島素分泌細(xì)胞的分化由相似的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控交替進(jìn)行[14]。Notch信號通過下游基因抑制Ngn3表達(dá)，保持小鼠胰腺祖細(xì)胞數(shù)量，以后Notch信號以濃度依賴的方式發(fā)揮作用；Notch低表達(dá)導(dǎo)致Ngn3激活和內(nèi)分泌分化，高水平Notch表達(dá)導(dǎo)致胰管細(xì)胞產(chǎn)生[15]。Notch信號通路早期活化抑制Ngn3表達(dá)，以阻止向胰島前體細(xì)胞方向分化[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，誘導(dǎo)至第7天和第14天Notch1和Ngn3 mRNA水平變化呈相反，提示體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人hUMSCs向胰島前體細(xì)胞分化過程中，Notch1和Ngn3也存在上述調(diào)控機(jī)制。胰島內(nèi)所有內(nèi)分泌細(xì)胞的前體細(xì)胞在早期均表達(dá)Ngn3，Ngn3基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)活化表達(dá)后，啟動胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序，胰腺祖細(xì)胞分別向內(nèi)分泌腺和外分泌腺方向分化[17]。小鼠胃旁路手術(shù)后觀察到Notch1受抑制，Ngn3水平升高從而促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生[18]。胰腺祖細(xì)胞Ngn3蛋白低水平表達(dá)是有內(nèi)分泌分化傾向細(xì)胞的特征，也是啟動內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵[19]。但Ngn3蛋白水平的調(diào)控目前尚不清楚，有報道Ngn3蛋白多位點(diǎn)磷酸化可以調(diào)控胰腺內(nèi)分泌分化，Ngn3蛋白去磷酸化可以促進(jìn)B細(xì)胞的體外生成，這有助于解釋在胰腺祖細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中，Ngn3表達(dá)從高到低的轉(zhuǎn)變[20]。

注：(1)與誘導(dǎo)期間各組比較，P<0.01；(2)與第7及第21天比較，P<0.01。圖8 各組Ngn3、Notch1蛋白表達(dá)水平Fig.8 The effect of induction on the expression of Ngn3 and Notch1 in each group

注：(1)與誘導(dǎo)第21天組比較，P<0.05。圖9 Western blot法檢測誘導(dǎo)21天組與阻斷組Ngn3、Notch1表達(dá)水平Fig.9 Western blot analysis of Ngn3 and Notch1on the 21st day groups of induction and inhibition

DAPT是人工合成的 γ分泌酶抑制劑，毒副作用較小，特異性強(qiáng)，可有效阻斷胞內(nèi)Notch受體酶切過程，使Notch無法激活，從而抑制Notch信號通路的活化過程，是目前公認(rèn)的Notch信號通路阻斷劑，常被用于研究Notch 信號通路[21-23]。Notch信號下調(diào)或抑制可促進(jìn)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞分化[24]。DAPT可通過減少Ngn3+/胰島素-細(xì)胞防止糖尿病小鼠β細(xì)胞去分化[25]，Xl等[26]用DAPT阻斷Notch 信號通路證實(shí)正常小鼠胚胎胰腺中Notch信號是Ngn3蛋白分子穩(wěn)定的主要調(diào)控因子。關(guān)于Notch 信號通路被阻斷后Ngn3變化的研究仍少見報道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Notch信號通路抑制劑能引起Ngn3表達(dá)增多，推測Notch信號通路的持續(xù)活化可能抑制hUMSCs向胰島前體細(xì)胞分化，但Notch1水平未見明顯變化，可能由于Notch1是細(xì)胞表面的受體，未受到細(xì)胞內(nèi)γ分泌酶抑制作用影響。有研究者在向肌源性干細(xì)胞中添加神經(jīng)生長因子后Notch1基因表達(dá)量下降，進(jìn)一步添加抑制劑后，Notch1表達(dá)量有所回升[27]。由此推測，Notch1與DAPT的相互作用可能受到誘導(dǎo)過程中添加的誘導(dǎo)因子作用影響。

綜上，Notch信號通路通過激活Notch1受體與下游基因Ngn3共同調(diào)控體外誘導(dǎo)hUMSCs向胰島前體細(xì)胞分化并進(jìn)一步分化為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的過程，但兩者存在的相互調(diào)節(jié)作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。