李曉杰，覃瑛，周誼霞,2**

(1.貴州醫(yī)科大學 護理學院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是目前引起全球因疾病死亡的主要原因，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)作為常見的心血管疾病，是導(dǎo)致心血管病患者死亡的主要因素[1]。As以動脈內(nèi)斑塊形成為主要特征，可導(dǎo)致冠狀動脈疾病、中風和外周血管疾病等多種并發(fā)癥[2]。有文獻表明，As的發(fā)生發(fā)展涉及內(nèi)皮細胞損傷、巨噬細胞極化、泡沫細胞形成以及平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化等幾種機制[3],在這些機制中，血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cell, VSMCs)的表型轉(zhuǎn)化失調(diào)被認為是As病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]。在正常生理狀態(tài)下，VSMCs表現(xiàn)出靜止的收縮表型，合成活性低、很少增殖[5]。在炎癥、機械損傷等病理生理學條件下，VSMCs表現(xiàn)出增殖表型[5]，具有高增殖和高遷移能力，從而有助于血管壁修復(fù)。然而，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，VSMCs過度增殖會導(dǎo)致表型轉(zhuǎn)化失調(diào)，促進動脈斑塊形成[4]。因此，抑制VSMCs過度增殖，防止異常的表型轉(zhuǎn)化已被認為是防治As的一種治療方法。橙皮素(hesperetin,HES)是一種3′，5′，7-三羥基-4-甲氧基黃烷酮，屬于黃酮類化合物，是柑橘類水果中含量最豐富的黃酮類化合物之一[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HES具有降血糖、降血脂改善動脈粥樣硬化的作用[6-7]，但其具體機制尚不清楚。本研究通過建立離體模型，觀察HES對大鼠原代胸主動脈VSMCs的影響，從VSMCs表型轉(zhuǎn)化的角度探討其可能的機制，為臨床上預(yù)防和治療As提供一定的實驗理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 4周齡健康雄性SD大鼠購自貴州醫(yī)科大學動物房[合格證號為SYXK(黔)2018-0001]，1只，體質(zhì)量85 g。

1.1.2主要試劑和儀器 Dulbecco's modified eagle medium/nutrient mixture F-12(DMEM ∶F-12)培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國Clark公司)，血小板源性生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB；美國R&D公司)，HES(中國Macklin公司)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(日本Dojindo化學研究所)，兔抗平滑肌肌動蛋白-α(α-smooth muscle actin，α-SMA)和平滑肌22α(Smooth muscle 22α，SM22α；中國Proteintech公司)，兔抗彈性蛋白原(elastin，ELN；中國Affinity公司)，兔抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA；中國萬類生物)，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和抗兔二抗[goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP，武漢Servicebio公司]；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-tek公司)，蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)及凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠原代胸主動脈VSMCs的提取 采用組織塊貼壁法提取大鼠原代VSMCs。取SD大鼠，以0.7 mL/kg的劑量腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉；75%酒精消毒皮膚，無菌環(huán)境下剝離并取出主動脈；主動脈放入盛有培養(yǎng)基的備用6 cm培養(yǎng)皿中，剝離外膜后用顯微剪中間剖開血管；輕刮內(nèi)膜，剪成1 mm×1 mm組織塊貼于培養(yǎng)瓶底部，均勻分布，加10%FBS 4 mL；培養(yǎng)瓶底部朝上，置于含5%CO2和95%O2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；1.5 h后將培養(yǎng)瓶反過來，使組織接觸培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每2～3 d換液1次，3～5 d可見少量細胞從組織塊爬出，2周左右長至培養(yǎng)瓶底部80%，待后續(xù)實驗使用。

1.2.2大鼠原代胸主動脈VSMCs的培養(yǎng)與α-SMA的鑒定 取1.2.1項下對數(shù)生長期的VSMCs置于10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，5%CO2、95%O2及飽和濕度的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2～3 d換液1次，取第3代對數(shù)生長期的細胞進行鑒定，按5個/L密度均勻接種于鋪有爬片的12孔板中，當密度長至70%時，采用細胞免疫熒光法對VSMCs標志性因子α-SMA進行鑒定。

1.2.3CCK-8法篩選藥物濃度及細胞分組 將1.2.1項下對數(shù)生長期的VSMCs按5×106個/L的密度均勻接種于96孔板，待VSMCs長至70%時，血清饑餓24 h，使VSMCs處于生長靜止期；加入2、5、10、25及50 μg/L PDGF-BB和10、50、100、150、200、250及300 μmol/L HES培養(yǎng)24 h，將CCK-8溶液與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1 ∶9混勻孵育2 h，于450 nm處測定吸光度值，根據(jù)吸光度值篩選出PDGF-BB最佳造模條件和HES最佳干預(yù)濃度；根據(jù)上述結(jié)果將VSMCs設(shè)置為對照組(0 μg/L PDGF-BB)、造模組(25 μg/L PDGF-BB)及加藥組(25 μg/L PDGF-BB+100 μmol/L HES)，待后續(xù)實驗用。

1.2.4劃痕實驗檢測VSMCs的細胞遷移 6孔板提前劃好橫線，每0.5cm劃1條線；取1.2.3項下各組對數(shù)生長期細胞以5×108個/L的密度均勻接種于6孔板，待細胞融合度長至100%時用1 mL吸頭垂直于橫線劃1條豎線，PBS清洗2次，血清饑餓24 h；加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/L的HES干預(yù)24 h，顯微鏡下記錄0和24 h的細胞遷移情況，采用Image J計算細胞遷移率。

1.2.5Western blot檢測VSMCs中α-SMA、SM22α、ELN和PCNA蛋白的表達 取1.2.3項下各組VSMCs經(jīng)胰酶消化后，按5×108個/L密度接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細胞融合度達到70%時血清饑餓24 h，加25 μg/L PDGF-BB和100 μmol/LHES培養(yǎng)24 h；PBS清洗2次，加RIPA裂解液冰上裂解提取總蛋白；BCA法蛋白定量后，120 V電壓電泳至溴酚藍跑到膠底部停止，220 mA轉(zhuǎn)膜100 min，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，α-SMA、SM22α、ELN及PCNA一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗3次、10 min/次，二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗3次、10 min/次，ECL發(fā)光液顯影，采用Image J統(tǒng)計灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 原代平滑肌細胞的培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)5 d有少量細胞從組織塊中爬出、貼壁生長，傳代培養(yǎng)2 d后細胞多呈長梭形，偶有三角形和星形，有典型的“峰-谷”狀特征；用平滑肌細胞特異性因子α-SMA對平滑肌細胞進行免疫熒光鑒定，平滑肌細胞純度>95%，高倍鏡下可見與細胞長軸平行的肌絲。見圖1。

注：A、B分別為光鏡下原代培養(yǎng)5 d及傳代培養(yǎng)2 d細胞形態(tài)(200×)，藍色箭頭指向“峰”、紅色箭頭指向“谷”；C(200×)、D(400×)為第3代培養(yǎng)2 d時免疫熒光鑒定結(jié)果。圖1 大鼠原代胸主動脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Culture and identification of rat primary thoracic aorta VSMCs

2.2 PDGF-BB對VSMCs的增殖作用

CCK-8檢測結(jié)果顯示，PDGF-BB處理24 h后VSMCs的活性呈濃度依賴性升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01，圖2A)；Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，25、50及100 μg/L組VSMCs的α-SMA和SM22α的蛋白表達水平分別明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但3組PDGF-BB比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2B和2C)，因此選擇25 μg/L的PDGF-BB濃度作為體外造模的干預(yù)濃度。

注：A為CCK-8檢測結(jié)果，B為Western Blot檢測結(jié)果，C為蛋白表達的定量結(jié)果；與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.001。圖2 不同濃度PDGF-BB對VSMCs的細胞增殖的影響Fig.2 The effect of different concentrations of PDGF-BB on cell proliferation of VSMCs

2.3 HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖的作用

CCK-8檢測不同濃度HES對PDGF-BB刺激VSMCs增殖活性的影響，結(jié)果顯示與空白對照組比較，造模組VSMCs增殖活性增強(P<0.001)；與造模組比較，除了濃度為10 μmol/L HES組外(P>0.05)，其余HES干預(yù)組VSMCs增殖活性均受到抑制(P<0.001)；當HES濃度≥100 μmol/L時，各實驗組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，故后續(xù)實驗選擇濃度為100 μmol/L的HES作為加藥組的干預(yù)濃度。見圖3。

注：(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖3 不同濃度HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖活性的影響Fig.3 The effects of different concentrations of hesperetin on the viability of VSMCs induced by PDGF-BB

2.4 HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力的影響

劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，造模組VSMCs遷移率增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與造模組比較，加藥組VSMCs遷移率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖4。

2.5 α-SMA和SM22α蛋白表達

Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，造模組VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，與造模組比較，加藥組VSMCs的α-SMA及SM22α蛋白表達水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖5。

2.6 ELN和PCNA蛋白表達

Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，造模組VSMCs合成表型因子ELN和PCNA蛋白表達水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與造模組比較，加藥組VSMCs的ELN、PCNA蛋白表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖6。

3 討論

據(jù)報道，CVD目前占所有死亡人數(shù)的40%以上[8]，As斑塊的形成與破裂是導(dǎo)致CVD患者死亡的主要因素[9]。本課題組在前期研究中對臨床血管性疾病人群進行了大數(shù)據(jù)的采集與統(tǒng)計分析，結(jié)果表明動脈血管的僵硬度與血流順應(yīng)性和血流動力學指標存在著明顯的相關(guān)性[10]。血流動力學改變最先累及血管壁，血管壁損傷及血管內(nèi)膜過度增生，最終會導(dǎo)致血管壁硬化、As形成，嚴重者會導(dǎo)致As斑塊破裂，引發(fā)急性CVD[11]。目前對As斑塊形成與破裂的機制研究存在多種觀點，其中VSMCs的表型轉(zhuǎn)化失調(diào)被認為是As病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，高達70%的As病變與VSMCs表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[12]。病理狀態(tài)下，由于動脈血管分泌過多的促細胞生長因子和趨化因子以及細胞外基質(zhì)分泌增多，會導(dǎo)致中膜的VSMCs過度增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化失調(diào)，參與As的發(fā)生發(fā)展[13]。因此，開發(fā)抑制VSMCs遷移、增殖及表型轉(zhuǎn)化的方法已成為As研究中的一個迫切問題。

注：(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖4 HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs遷移能力的影響Fig.4 The effect of hesperetin on PDGF-BB induced VSMCs migration

注：(1)與對照組比較，P<0.001；(2)與造模組比較，P<0.001。圖5 HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs α-SMA和SM22α 蛋白表達的影響Fig.5 The effect of hesperetin on VSMCs α-SMA and SM22α protein expression induced by PDGF-BB

注：與對照組比較，(1)P<0.001，與造模組比較，(2)P<0.001。圖6 HES對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs ELN和PCNA蛋白表達的影響Fig.6 The effect of hesperetin on the expression levels of ELN and PCNA induced by PDGF-BB

探究VSMCs功能常用的細胞有原代細胞和細胞株2種，已有研究表明VSMCs細胞株隨著傳代次數(shù)增加，其固有的生理學特征往往會發(fā)生改變，不能很好地模擬體內(nèi)生理狀態(tài)，不利于As的深入研究[14]。為了保證VSMCs的性狀和生物學特性接近預(yù)期生理狀態(tài)，有學者于20世紀70年代提出分離原代VSMCs的方法[15]。VSMCs的原代培養(yǎng)方法有酶消化法和組織塊貼壁法，因前者存在價格昂貴、消化時間和配比濃度不好把控、細胞獲得量少及活性差的缺點[16-18]，故本研究采用組織塊貼壁法提取SD大鼠胸主動脈VSMCs[19]。本研究原代細胞的提取過程中，將外膜剝離干凈，刮去內(nèi)膜，避免了內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的污染，確保了原代VSMCs的純度；細胞分離與培養(yǎng)過程中，為了提高VSMCs的獲得率和純度，要注意以下幾點：(1)為保證VSMCs的穩(wěn)定性和生命力，選取4周齡身體健康的SD大鼠作為研究對象；(2)為提高VSMCs的活性，不可過度牽拉血管；剪組織的剪刀要盡可能鋒利，使組織塊邊緣平整；(3)為了防止污染，全程應(yīng)注意無菌操作；(4)原代培養(yǎng)前3天要絕對靜置，不用換液。本實驗建立了穩(wěn)定的大鼠原代胸主動脈VSMCs體外培養(yǎng)模型，采用細胞免疫熒光化學法對VSMCs進行鑒定，純度>95%，傳代培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇后，細胞仍然比較穩(wěn)定，為后續(xù)細胞實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。

PDGF能夠調(diào)節(jié)血管形成，PDGF家族由5種類型或同源二聚體組成，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC及PDGF-DD[20-21]。PDGF-BB被認為是VSMCs從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的最有效的刺激劑之一[22]。外源性PDGF-BB能刺激VSMCs分裂和增殖，加速細胞外基質(zhì)和膠原的形成，從而縮短愈合時間[23-24]。本研究采用PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs增殖模型，CCK-8結(jié)果表明PDGF-BB處理后VSMCs增殖活性明顯增加。有研究表明，PDGF-BB是VSMCs分裂所必需的元素，本質(zhì)上PDGF-BB允許VSMCs跳過G1檢查點進行分裂,在傷口愈合中扮演著重要的作用[25]。本研究中劃痕實驗結(jié)果表明 PDGF-BB能夠顯著增強VSMCs的遷移能力。

VSMCs含有1組特殊的細胞骨架蛋白，這些蛋白通常與細胞收縮有關(guān)，通常用作跟蹤內(nèi)膜增生、管腔狹窄以及As中發(fā)生的表型變化的標志物[26]。VSMCs最普遍的標志是α-SMA，這是典型的VSMCs肌動蛋白亞型，α-SMA在VSMCs中表達，即使在發(fā)育的早期也是如此[27]。其他常用的細胞骨架蛋白還包括SM22α、Calponin及非肌肉肌球蛋白重鏈亞型A和B[28]。然而合成表型的識別主要依賴于成熟或分化表型的細胞骨架標志物，其表達減少或缺失及增殖相關(guān)標志物(ELN和PCNA)的高表達。以往研究中，PDGF-BB通常被用來誘導(dǎo)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB抑制了VSMCs收縮表型標志因子α-SMA和SM22α蛋白的表達，增加了合成表型ELN和PCNA蛋白的表達，表明PDGF-BB促進了VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化。

HES是從柑橘、柚子及檸檬等蕓香科中分離得到的天然黃酮類化合物[30]。已有研究證明HES具有明顯的抗氧化、抗炎及抗增殖作用[31-32]。Jeong等[33]在動物高脂飼料中添加0.05% HES衍生物，喂飼10 d后發(fā)現(xiàn)HES衍生物具有明顯的降血脂作用；Jayarman等[6]研究發(fā)現(xiàn)HES對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有降血糖、抗氧化和降血脂的作用，表明服用HES后可通過改善大鼠的抗氧化能力來減輕高血糖和血脂異常；Sugasawa等[7]實驗表明，HES對APOE-/-小鼠As進展具有保護作用。本研究將HES應(yīng)用于PDGF-BB刺激的VSMCs中，發(fā)現(xiàn)HES抑制了PDGF-BB對VSMCs的促增殖作用和促遷移作用；Western Blot結(jié)果表明加入HES后VSMCs收縮表型標志因子α-SMA及SM22α蛋白的表達上升，合成表型標志因子ELN和PCNA蛋白的表達下降，表明HES成功逆轉(zhuǎn)了PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化這一過程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HES可以明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)大鼠原代胸主動脈VSMCs的增殖和遷移，增加收縮表型標志蛋白α-SMA和SM22α的表達，降低合成表型標志蛋白ELN和增殖蛋白PCNA的表達。由此可認為，HES可以通過抑制VSMCs從收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)化，從而逆轉(zhuǎn)As的發(fā)生發(fā)展，可為As基礎(chǔ)防治提供新的參考依據(jù)。