菅曉婷，付 超，岳 丹，杜圣家，郭林芝

脂肪組織是機(jī)體重要的能量倉(cāng)庫(kù)，廣泛分布于全身的皮下及內(nèi)臟各處[1]，薄層疏松的結(jié)締組織將其分割成許多小葉結(jié)構(gòu)[2]，小葉內(nèi)有大量的脂肪細(xì)胞。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)脂肪組織的研究[3-5]，而這些研究都離不開(kāi)形態(tài)學(xué)方面(如HE、免疫組化染色)的觀察。因此，制作優(yōu)質(zhì)的脂肪組織切片標(biāo)本至關(guān)重要。由于脂肪組織結(jié)構(gòu)特殊，含有大量的油脂成分，如果組織固定、脫水脫脂不完全，切片時(shí)往往出現(xiàn)組織碎渣，有空洞、觸摸較軟、放置后蠟塊表面有凹陷、不易保存等各種問(wèn)題影響后續(xù)的觀察及研究[6-8]。本實(shí)驗(yàn)室參照董學(xué)易等[9]的方法制作脂肪組織石蠟切片，雖基本滿足形態(tài)學(xué)研究，但整個(gè)流程所用時(shí)間較長(zhǎng)，效率較低，減慢了科研進(jìn)程。為制作更好的脂肪組織石蠟切片，同時(shí)縮短制作時(shí)間，本科室在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并應(yīng)用于免疫組化和免疫熒光染色，獲得了較為滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c雄性小鼠6只，8周齡，體重22～25 g，均購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Leica RM2245型半自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)；10%中性福爾馬林、95%乙醇、二甲苯購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；切片石蠟(熔點(diǎn)60～62 ℃)購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑公司；蘇木精、伊紅染液購(gòu)自珠海貝索公司；Rabbit Anti-GLP-1R antibody(貨號(hào)bs-1559R)購(gòu)自北京博奧森生物公司；山羊抗兔IgG/HRP聚合物(貨號(hào)PV-6001)和山羊抗兔IgG/TRITC(貨號(hào)ZF-0316)均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1取材及組織處理 頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)小鼠，每只鼠分別取雙側(cè)睪丸脂肪墊，雙側(cè)腎周脂肪組織及2塊大小均等的腸系膜脂肪組織，標(biāo)本共36塊，大小為(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm×(0.2～0.3)cm，三個(gè)部位的脂肪組織均等分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各18塊。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林浸泡固定。其中，對(duì)照組標(biāo)本采用董學(xué)易等[9]所述程序進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本采用改進(jìn)程序進(jìn)行(表1)。處理好的脂肪組織標(biāo)本用Leica石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋。

表1 兩組脂肪組織處理流程表

1.2.2切片、展片及烤片 用Leica RM2245型半自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚4 μm。在水溫42 ℃進(jìn)行展片，60 ℃烤片30 min～1 h。

1.2.3HE、免疫組化及免疫熒光染色 HE、免疫組化及免疫熒光染色按常規(guī)流程進(jìn)行，抗體為Rabbit Anti-GLP-1R antibody，陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，免疫組化采用DAB顯色，免疫熒光采用TRITC顯色。

2 結(jié)果

2.1 兩組脂肪組織切片、展片及HE染色比較實(shí)驗(yàn)組脂肪組織蠟塊質(zhì)地均勻，組織完整，呈淡黃色半透明狀，可進(jìn)行連續(xù)切片，且切片完整無(wú)空洞，無(wú)碎渣，展片完全，無(wú)褶皺，組織未散。經(jīng)HE染色，鏡下可見(jiàn)脂肪組織無(wú)裂縫，細(xì)胞排列緊密，形態(tài)飽滿，呈多邊形空泡狀，胞核呈扁圓形，清晰可見(jiàn)，胞膜無(wú)明顯斷裂、松散(圖1A)。

對(duì)照組脂肪組織石蠟塊與實(shí)驗(yàn)組石蠟塊相比無(wú)明顯區(qū)別，可連續(xù)切片，但組織中央可見(jiàn)細(xì)小裂縫，展片后明顯。經(jīng)HE染色，鏡下可見(jiàn)脂肪組織形態(tài)基本完整，局部可見(jiàn)裂縫，細(xì)胞排列緊密，但形態(tài)欠飽滿，胞核扁平，清晰可見(jiàn)，部分細(xì)胞膜有斷裂，松散(圖1B)。

2.2 實(shí)驗(yàn)組脂肪組織石蠟切片在免疫組化和免疫熒光中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)組切片在進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色過(guò)程中未見(jiàn)明顯脫片，鏡下可見(jiàn)脂肪組織完整，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞膜完整，免疫組化標(biāo)記GLP-1R呈棕黃色，免疫熒光可見(jiàn)較強(qiáng)的紅色信號(hào)，陽(yáng)性表達(dá)明顯，背景清晰(圖2)。

①A①B②A②B

3 討論

脂肪組織主要由脂肪細(xì)胞構(gòu)成，脂肪細(xì)胞內(nèi)含有大量脂滴，而脂滴的主要成分是三酰甘油脂。由于其成分的特殊性，不能按照普通組織的脫水流程進(jìn)行處理，若脫水、脫脂不完全，石蠟便難以進(jìn)入組織從而起不到支撐作用，蠟塊中的組織會(huì)塌陷、皺縮，切片時(shí)會(huì)出現(xiàn)空洞，碎渣等情況。實(shí)驗(yàn)室常用的脫水、脫脂試劑為乙醇，乙醇分子中含有極性基團(tuán)羥基(-OH)，與組織中的水形成氫鍵將水置換出來(lái)起到脫水作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，作者認(rèn)為對(duì)于含水少的脂肪組織，乙醇除了有脫水作用，還可以與三酰甘油脂發(fā)生醇解反應(yīng)，生成水溶性的甘油和乙酯，將脂肪細(xì)胞中的脂滴溶解，從而使浸蠟更為徹底。也有文獻(xiàn)記載乙醇脫脂是利用乳化作用[10]。但是，不論乙醇是應(yīng)用何種原理脫脂，都會(huì)消耗大量乙醇，所以我們需要延長(zhǎng)乙醇處理組織的時(shí)間。雖然有研究表明溫度一定的條件下，乙醇濃度越高，脫脂率會(huì)越高[11]，但高濃度的乙醇迅速脫水，會(huì)使組織收縮，表面變硬，進(jìn)而影響乙醇繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)脫水脫脂，所以應(yīng)當(dāng)從低濃度乙醇開(kāi)始逐漸向高濃度乙醇梯度過(guò)渡，并且延長(zhǎng)中低濃度乙醇脫水時(shí)間。本文實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，增加了70%乙醇和90%乙醇，并延長(zhǎng)了在低濃度乙醇中的時(shí)間，縮短了在高濃度乙醇中的時(shí)間，組織充分脫水脫脂，取得了較為滿意的制片效果。而對(duì)照組程序乙醇梯度設(shè)置少，且脫水、脫脂時(shí)間延長(zhǎng)主要在95%乙醇，以至組織迅速收縮，乙醇很難進(jìn)入細(xì)胞溶解置換脂質(zhì)并進(jìn)行脫水，最后制作的石蠟塊在切片時(shí)有裂縫，使形態(tài)學(xué)觀察及后續(xù)研究受到一定影響。

此外，二甲苯不僅有透明作用，也有良好的脫脂效果，二甲苯可以兼顧乙醇脫脂不徹底的情況[12]，但是組織浸泡二甲苯時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)硬化變脆。制作一張優(yōu)質(zhì)的脂肪切片，固定也尤為重要，固定液體積要為標(biāo)本體積的10～20倍[13]，并且蓋上紗布以防脂肪組織漂浮固定不充分，但固定時(shí)間越長(zhǎng)，抗原被封閉和破壞越多，影響免疫組化及分子生物學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性率。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組縮短了固定時(shí)間，不僅制出優(yōu)質(zhì)切片，而且免疫組化及免疫熒光染色檢測(cè)陽(yáng)性率高，效果良好。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)小鼠脂肪組織石蠟切片的制作流程，使用改良流程制作的切片組織形態(tài)完整，無(wú)裂縫，無(wú)褶皺，經(jīng)染色可見(jiàn)胞膜完整，胞核清晰，抗原保存好，極大地提高了科研的進(jìn)度，為后續(xù)科研的進(jìn)行提供了優(yōu)質(zhì)的切片基礎(chǔ)。