楊 艷，陳 盛，張 磊，葉傳進(jìn)，黃曉峰

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的發(fā)病率占頭頸部腫瘤的24%，術(shù)后局部復(fù)發(fā)是影響早期OSCC患者5年生存率的主要原因[1]，因此尋找有效的生物學(xué)標(biāo)志物有望改善早期OSCC患者的預(yù)后。PDCD4是位于人類(lèi)染色體10q24的抑癌基因[2]。與正常組織相比，PDCD4在結(jié)直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和甲狀腺髓樣癌等多種癌癥中的表達(dá)較低[3-4]。PDCD4可以與eIF4A1結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5-6]。然而，PDCD4/eIF4A1信號(hào)在OSCC中的臨床意義尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化檢測(cè)早期OSCC中PDCD4/eIF4A1信號(hào)在腫瘤中的分布，并分析PDCD4/eIF4A1信號(hào)表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，探討其對(duì)于早期OSCC患者預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院2007～2014年診斷的50例早期OSCC(T1/T2N0M0)。根據(jù)國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)腫瘤TNM分期系統(tǒng)對(duì)患者臨床分期進(jìn)行分類(lèi)。所有患者均未在手術(shù)前接受化療或放療；并對(duì)50例OSCC患者進(jìn)行隨訪，隨訪日期截至2019年1月。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均獲得知情同意書(shū)，所收集標(biāo)本均按照倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)處理。

1.2 免疫組化anti-PDCD4(1∶200；ab80590；Abcam公司);anti-eIF4A1(1∶200；ab31217；Abcam公司)。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，免疫組化行SP法染色，DAB顯色。然后在PBS中清洗所有切片。蘇木精襯染，鹽酸乙醇分化，藍(lán)化后梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定PDCD4、eIF4A1染色結(jié)果由兩名高級(jí)病理醫(yī)師對(duì)每種表達(dá)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度對(duì)免疫組化染色進(jìn)行綜合評(píng)分[7-8]。PDCD4、eIF4A1鏡下以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。采用半定量積分法判斷結(jié)果：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占1%～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘，PDCD4和eIF4A1高、低表達(dá)由評(píng)分的中位數(shù)確定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0和Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Pearson χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)比較與患者臨床病理特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier曲線分析PDCD4、eIF4A1表達(dá)與總生存期之間的關(guān)系。在多變量分析中，采用Cox回歸模型檢驗(yàn)不同預(yù)后因素之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 早期OSCC中PDCD4和eIF4A1的表達(dá)及其相關(guān)性免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞中可見(jiàn)廣泛分布的PDCD4和eIF4A1(圖1)。PDCD4高表達(dá)24例，低表達(dá)26例，eIF4A1高表達(dá)26例，低表達(dá)24例。由于PDCD4與eIF4A1之間的相互作用已經(jīng)得到證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腫瘤的相同區(qū)域中PDCD4和eIF4A1的表達(dá)具有相反的趨勢(shì)(P=0.022)，當(dāng)PDCD4高表達(dá)時(shí)，同一區(qū)域的eIF4A1表達(dá)有降低趨勢(shì)(表1)。50例標(biāo)本連續(xù)切片的染色結(jié)果顯示，PDCD4和eIF4A1的染色強(qiáng)度在同一樣本的同一區(qū)域具有相反的趨勢(shì)(圖2)。

表1 OSCC中PDCD4與eIF4A1表達(dá)的相關(guān)性

2.2 OSCC中PDCD4/eIF4A1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系考慮到PDCD4/eIF4A1信號(hào)與OSCC進(jìn)展相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了不同信號(hào)表達(dá)模式與早期OSCC患者臨床病理特征的相關(guān)性(表2)。結(jié)果顯示：PDCD4和eIF4A1表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙和T分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，但本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)PDCD4和腫瘤分化程度較低(P<0.000 1)、WPOI較差(P=0.001)有關(guān)，而高表達(dá)eIF4A1和腫瘤分化程度低(P=0.005)、WPOI較差(P=0.005)也密切相關(guān)。上述結(jié)果提示，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的PDCD4可能負(fù)性調(diào)節(jié)eIF4A1的功能以促進(jìn)OSCC的惡性表型。

2.3 PDCD4、eIF4A1表達(dá)與OSCC預(yù)后的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)將50例OSCC患者分為PDCD4高、低表達(dá)組和eIF4A1高、低表達(dá)組，對(duì)PDCD4/eIF4A1信號(hào)表達(dá)與總生存率之間的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：腫瘤細(xì)胞中PDCD4低表達(dá)與總生存時(shí)間較短相關(guān)(P=0.000 3)，而eIF4A1高表達(dá)與總生存時(shí)間較短相關(guān)(P=0.001 1，圖3)。上述結(jié)果表明，PDCD4和eIF4A1對(duì)OSCC預(yù)后的影響呈相反的趨勢(shì)。

2.4 OSCC預(yù)后的影響因素本實(shí)驗(yàn)采用單變量和多變量分析OSCC各臨床病理特征對(duì)預(yù)后的影響及意義。結(jié)果顯示，患者年齡、吸煙、分化、WPOI和eIF4A1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不是患者總生存期的預(yù)后指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞中PDCD4低表達(dá)(P<0.001)、T分期(P=0.002)是OSCC的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。eIF4A1表達(dá)并不是早期OSCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.923，表3)。

3 討論

PDCD4/eIF4A1信號(hào)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的病理學(xué)意義，因此有必要研究PDCD4/eIF4A1信號(hào)在早期OSCC中表達(dá)的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)早期OSCC中PDCD4/eIF4A1信號(hào)的不同表達(dá)模式進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中PDCD4低表達(dá)和eIF4A1的高表達(dá)具有促癌作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在OSCC腫瘤細(xì)胞中PDCD4/eIF4A1信號(hào)的表達(dá)模式與以往在其他腫瘤細(xì)胞的研究結(jié)果一致。

表3 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌無(wú)瘤生存率預(yù)后因素的預(yù)測(cè)

圖3 PDCD4(A)、eIF4A1(B)的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的的關(guān)系

前期研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中PDCD4表達(dá)缺失與患者較差的生存率和較低的無(wú)瘤生存率相關(guān)，eIF4A1也被發(fā)現(xiàn)可以預(yù)測(cè)乳腺癌的不良預(yù)后[9]。然而，目前對(duì)它們?cè)谕荒[瘤中的共表達(dá)模式的預(yù)后價(jià)值知之甚少，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDCD4與eIF4A1在腫瘤組織相同部位具有相反的表達(dá)模式。同時(shí)，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)PDCD4或低表達(dá)eIF4A1與更高的總生存率相關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示，腫瘤細(xì)胞低表達(dá)PDCD4是OSCC生存率的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，早期OSCC中PDCD4/eIF4A1信號(hào)表達(dá)水平與反映原發(fā)性腫瘤進(jìn)展的病理參數(shù)有關(guān)，包括最初診斷時(shí)的分化程度和WPOI，同時(shí)異常的PDCD4/eIF4A1信號(hào)表達(dá)水平也可預(yù)測(cè)早期OSCC的不良預(yù)后。