柯藝文，吳 春，張 馨

微小RNA(microRNA, miR)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，在細胞增殖、凋亡、侵襲、血管再生等多種生理病理過程中起重要作用。目前已發(fā)現多個miR可作為卵巢漿液性癌的獨立預后因子，如miR-613[1]、miR-21[2]等。miR-203定位于人染色體14q32-33，為特異性上皮miR，文獻報道m(xù)iR-203在不同類型腫瘤中的表達水平存在差異，如miR-203在喉癌中表達降低[3]，而在乳腺癌中表達增加[4]，目前關于miR-203在卵巢癌中的表達情況尚不明確。Tian等[5]研究發(fā)現，miR-595在卵巢癌組織樣本及細胞株中均表達下降，而關于miR-595在卵巢漿液性癌中的表達情況相關研究甚少。本實驗采用RT-PCR技術檢測卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595的表達情況，探討其表達與患者病情進展、預后的關系，并評估其在卵巢漿液性癌預后預測中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料收集2011年1月～2014年11月海南省?？谑袐D幼保健院行手術治療的卵巢漿液性癌手術組織樣本(癌組織及癌旁正常組織)，共收集45例符合標準的卵巢漿液性癌標本。納入標準：病歷資料完整，術前未接受放、化療及激素治療，術后病理診斷為卵巢漿液性癌，完成術后隨訪。排除標準：合并感染性疾??；合并嚴重器質性疾?。缓喜⑵渌麗盒阅[瘤。本實驗經本院倫理委員會審核通過，組織樣本采集符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》。采用門診復查或電子通訊方式，對患者進行為期5年的術后隨訪，直至隨訪時間截止或患者死亡，本組45例患者中位隨訪時間為(48.09±7.49)個月。Trizol(美國Invitrogen公司)，miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化公司)，反轉錄試劑盒(上海碧云天生物公司)，逆轉錄引物及RT-PCR引物(金斯瑞生物公司)，SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，紫外分光光度計(美國Thermo公司)，RT-PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 RT-PCRmiRcute miRNA提取分離試劑盒提取組織中的miRNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，miR-203逆轉錄引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTAG TGGT-3′，miR-595逆轉錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAG-3′。SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒進行RT-PCR試驗，所有操作均嚴格遵守試劑盒說明書，RT-PCR引物：miR-203正向引物5′-ACACTCCAGCTGGCGTGAAATGTTTAGGACCA-3′，反向引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；miR-595正向引物5′-GCGGCAACCCGTAGATCCGAA-3′，反向引物5′-GTGCAGGG TCCGAGGT-3′；U6正向引物5′-CGCTTCGGCAGCACATATA C-3′，反向引物5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。RT-PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，合計40個循環(huán)，以2-ΔΔCt計算miR-203、miR-595的相對表達量。

2 結果

2.1 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595的表達RT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比，卵巢漿液性癌組織中miR-203相對表達量增加，而miR-595相對表達量降低，差異均有統計學意義(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595的表達

2.2 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595表達與臨床病理特征的關系卵巢漿液性癌中miR-203表達與患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級、CA125表達無關(P均>0.05)，與淋巴結轉移、FIGO分期有關(P均<0.05)；miR-595表達與患者年齡、腫瘤直徑、CA125無關(P均>0.05)，與組織學分級、淋巴結轉移、FIGO分期相關(P均<0.05，表2)。

2.3 miR-203、miR-595表達與卵巢漿液性癌患者預后的關系以miR-203表達量中位數(2.96)為界，將卵巢漿液性癌患者分為miR-203高表達組(22例)和miR-203低表達組(23例)，Kaplan-Meier結果顯示，miR-203高表達組患者的術后5年總生存率為18.19%(4/22)，中位生存時間為26.57個月，miR-203低表達組患者的術后5年總生存率為47.83%(11/23)，中位生存時間為39.54個月，兩組相比差異有統計學意義(Log-rank χ2=5.306，P=0.021，圖1)。

以miR-595表達量中位數(0.30)為界，將卵巢漿液性癌患者分為miR-595高表達組(22例)和miR-595低表達組(23例)，Kaplan-Meier結果顯示，miR-595高表達組患者的術后5年總生存率為50.00%(11/22)，中位生存時間為36.27個月，miR-595低表達組患者的術后5年總生存率為17.39%(4/23)，中位生存時間為30.28個月，兩組相比差異有統計學意義(Log-rank χ2=4.311，P=0.038，圖1)。

2.4 Cox回歸模型分析卵巢漿液性癌預后的影響因素建立Cox比例回歸模型，因變量為卵巢漿液性癌預后狀況，選擇組織學分級、淋巴結轉移、FIGO分期、miR-203表達、miR-595表達等5個指標為自變量，回歸過程采用逐步后退法，以行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。結果顯示：淋巴結轉移、較高FIGO分期、miR-203高表達、miR-595低表達是卵巢漿液性癌患者預后的獨立危險因素(P均<0.05，表3)。

表2 卵巢漿液性癌中miR-203、miR-595表達與臨床病理特征的關系

表3 卵巢漿液性癌預后影響因素的分析結果

圖1 Kaplan-Meier曲線分析miR-203、miR-595表達與患者預后的關系：A.miR-203；B.miR-595

2.5 聯合檢測miR-203、miR-595對卵巢漿液性癌的預后預測價值

2.5.1各指標單獨應用對預后的預測價值 以本組中死亡病例(30例)為陽性樣本，生存病例(15例)為陰性樣本，再將卵巢漿液性癌組織中miR-203、miR-595以及當前臨床上已用的血清CA125等共3個指標水平劃分成7～9個組段，建立ROC診斷分析模型。經ROC分析結果顯示：三指標均具有一定的卵巢漿液性癌預后預測價值，ROC曲線下面積(AUC)均在0.74以上。在其理論閾值點處，敏感度和特異度也均大于0.7(表4，圖2)。

2.5.2三指標聯合應用對預后的預測價值 以該三指標各自的閾值為診斷閾值，對各樣本作陰性或陽性判斷。若三指標均為一致陽性或陰性時作出樣本的陽或陰性診斷，有一個指標不一致時則對其進行復測，復測未改變時即認可兩指標相同的診斷結果，同時與臨床醫(yī)師會商。如此計算得：血清CA125、癌組織中miR-203、miR-595聯合檢測診斷的靈敏度和特異度分別為0.900(27/30)和0.867(13/15)。這說明三指標聯合應用較之于各指標單獨應用，可使對卵巢漿液性癌的預后預測效能得到明顯的提升(表4)。

表4 miR-203、miR-595對卵巢漿液性癌診斷的ROC結果

3 討論

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，但病死率居婦科腫瘤的首位。約90%卵巢癌為卵巢漿液性癌，每年新發(fā)病例數約22萬，死亡病例數約14萬，嚴重威脅女性生命健康[6]。目前的臨床治療方案可顯著提高患者的生存質量，但晚期患者的5年總生存率較低。此外，卵巢漿液性癌發(fā)病隱匿，臨床上亟需尋找靈敏度高的診斷及預后預測的生物標志物，以提高患者的早期診斷率、改善患者預后。卵巢癌近年來，在腫瘤診斷及治療方面取得了較大進展，但卵巢癌患者的5年存活率仍較低，缺乏有效的早期篩查敏感性和特異性均較高的生物標志物是重要原因之一。近年研究發(fā)現，miR是較為理想的卵巢癌生物標志物。

CA125是臨床應用最廣泛的血清腫瘤標志物，在卵巢癌晚期患者中，其血清水平升高明顯，但近50%早期卵巢癌患者的血清CA125水平無變化，對早期患者的診斷靈敏度不高，且其血清水平易受多種生理(如妊娠等)、病理(如子宮內膜異位癥等)狀態(tài)影響，導致其臨床應用受到限制[7]。

圖2 miR-203、miR-595、CA125對卵巢漿液性癌預后預測的ROC曲線：A.miR-203；B.miR-595；C.CA125

研究證實，miR-203與卵巢癌、子宮頸癌、子宮內膜癌等婦科腫瘤關系密切[8]。本實驗結果顯示，與癌旁正常組織相比，癌組織中miR-203表達增加，提示miR-203異常高表達可能參與了卵巢漿液性癌的發(fā)生，發(fā)揮促癌基因作用。Zhao等[9]認為miR-203可抑制卵巢癌細胞的上皮-間質轉化過程，發(fā)揮抑癌基因功能，與本結論相悖，筆者初步分析，這可能是組織樣本與細胞株之間的差異所致，后續(xù)研究將在細胞水平進一步論證本實驗結論；此外，本實驗結果發(fā)現，癌組織中miR-203高表達與淋巴結轉移、較高FIGO分期相關，miR-203高表達患者的術后5年總生存率低、中位生存時間短，初步證實miR-203高表達可誘發(fā)卵巢漿液性癌的發(fā)生及惡性進展。Cox回歸模型結果顯示，miR-203高表達是影響患者預后的獨立危險因素，以上結果證實，miR-203具有作為卵巢漿液性癌生物標志物的潛能。

miR-595是近年研究發(fā)現的新miR分子，其功能尚未明確，有研究證實miR-595異常表達與骨髓增生異常綜合征[10]、下頜前突[11]相關，且可作為肝硬化[12]、炎癥性腸病[13]的生物標志物。本實驗發(fā)現miR-595在卵巢漿液性癌組織中表達降低，且與組織學分級、淋巴結轉移、FIGO分期及不良預后相關，是患者預后的獨立危險因素，提示miR-595具有抑癌基因功能，且與卵巢漿液性癌的發(fā)生、惡性進展及不良預后關系緊密，可作為卵巢漿液性癌的生物標志物，與Tian等[5]的研究結論一致；但有研究發(fā)現，miR-595高表達可導致白血病細胞的化療耐藥[14]、促進膠質細胞瘤的細胞增殖[15]，提示miR-595同時具有促癌基因、抑癌基因功能。筆者初步分析，miR-595作為轉錄后調控因子，與靶基因間存在一對多、多對一的復雜調控網絡，且不同腫瘤細胞中，不同基因的表達豐度存在較大差異，進而導致miR-595可能同時具有促癌和抑癌功能，后續(xù)研究將深入探究miR-595在卵巢漿液性癌中的分子作用機制，以期從分子生物學水平闡述并支持本研究結論。ROC曲線結果顯示，miR-203、miR-595對卵巢漿液性癌具有較好的預后預測價值，其靈敏度和特異度均在0.7以上，聯合檢測CA125、miR-203、miR-595，靈敏度和特異度顯著提升，提示在卵巢漿液性癌的預后判斷中CA125、miR-203、miR-595聯合檢測具有較好的臨床應用價值。

綜上所述，卵巢漿液性癌組織中miR-203高表達，miR-595低表達，兩者均是患者不良預后的獨立危險因素，具有作為卵巢漿液性癌生物標志物的潛能；檢測miR-203、miR-595可能有助于卵巢漿液性癌患者的預后預測。