茍繼周，李曉星，孫 炎，彭 程，張鴻英，趙 霞，孫宜康，羅偉仁，喻 宏

人類感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)會引起不同程度病變的肝臟疾病，有急性感染和慢性感染，而慢性感染有不同的臨床表現(xiàn)，從輕度肝炎到肝硬化，最終發(fā)展成肝癌和終末期肝功能衰竭[1]。有關(guān)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的發(fā)病機制研究表明，機體感染HBV后并不直接對肝細胞造成損傷，而是HBV在肝細胞內(nèi)復(fù)制，引起機體的免疫應(yīng)答損傷肝細胞所致[2]。感染HBV后引起的肝損傷免疫應(yīng)答的細胞通路非常復(fù)雜，在影響機體免疫應(yīng)答的眾多因素中，CD4+輔助性T細胞發(fā)揮的應(yīng)答對感染的預(yù)后有重要影響[2]。那么T-bet作為CD4+Th1型細胞的分化轉(zhuǎn)錄因子，在CHB免疫應(yīng)答中發(fā)揮什么作用呢？已有研究通過RT-PCR檢測外周血中CD4+輔助性T細胞的T-bet mRNA表達[3]。外周血研究并不能準確的反映肝組織內(nèi)的實際情況[4]。目前，T-bet在CHB肝組織中的表達及與臨床病理特征的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。本實驗采用免疫組化法檢測T-bet在CHB肝組織中的表達，并對其在CHB發(fā)生、發(fā)展中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集深圳市第三人民醫(yī)院(南方科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院)2010年1月～2013年3月收治的62例CHB，其中男性47例，女性15例，年齡24～66歲，中位年齡(36.4±9.36)歲。所有患者HBsAg陽性，HBeAg或抗-HBe陽性，HBV DNA陽性或陰性，均經(jīng)肝穿刺活檢。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年)[5-6]，并對病理炎癥分級進行分組，其中G1組23例，G2組19例，G3組12例，G4組8例；按纖維增生程度分組，其中S1組15例，S2組16例，S3組17例，S4組14例。所有患者均排除其他肝炎病毒重疊感染或酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和藥物性肝炎等其他肝病。

1.2 主要試劑兔抗人T-bet(1∶100稀釋)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；鼠抗人CD4單克隆抗體(即用型)和ChemMate EnVision檢測試劑盒均購自Dako公司。

1.3 方法肝組織在彩超引導(dǎo)下通過彈射式組織活檢槍方法取得，長約1.5 cm，取材后立即經(jīng)10%中性福爾馬林固定、常規(guī)脫水、浸蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。依次行HE染色、天狼猩紅染色。由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法獨立在光鏡下對肝組織病理變化進行評價，并對其炎癥和纖維化進行分級分期。3 μm厚肝組織切片常規(guī)脫蠟至水，采用高壓熱修復(fù)抗原。滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min(CD4使用0.3%過氧化氫)，滴加一抗4 ℃過夜。PBS沖洗后滴加二抗37 ℃孵育45 min。PBS沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。以上操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。以PBS替代一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。所有切片采用同一批試劑完成。

1.4 結(jié)果判斷T-bet表達定位于細胞核，CD4表達定位于細胞膜，均呈棕黃色為陽性。T-bet、CD4陽性細胞數(shù)判定標準：在高倍鏡下對整條肝組織進行觀察，然后對匯管區(qū)內(nèi)陽性細胞進行計數(shù)，并統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 CHB肝組織中T-bet的表達在CHB肝組織中，T-bet呈散在或聚集分布(圖1)；絕大部分T-bet分布在匯管區(qū)、界板、橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)；小葉中有少量表達，但大多散在分布，也有一些灶性表達(圖2)。

2.2 CHB不同分級分期中T-bet的表達G1級CHB肝組織中，匯管區(qū)有少量的T-bet陽性細胞(圖3)；G2級CHB肝組織中，匯管區(qū)有中等量的T-bet陽性細胞(圖4)，界面炎的肝細胞間也有少量T-bet陽性細胞；G3級CHB肝組織中，除匯管區(qū)有多量的T-bet陽性細胞外，橋接壞死區(qū)也有較多的T-bet陽性細胞(圖5)；G4級CHB肝組織中，匯管區(qū)和融合壞死區(qū)可見大量的T-bet陽性細胞(圖6)。隨著CHB炎癥逐漸加重，T-bet在肝組織內(nèi)的陽性表達逐漸增多(r=0.869，P<0.01，表1)；同時，T-bet在CHB肝組織的表達隨著纖維化程度加重而增多(r=0.423，P<0.01，表1)。

表1 CHB不同分級、分期中T-bet表達水平的比較

2.3 T-bet與CD4表達的相關(guān)性隨著CHB病理分級分期的加重，CD4表達增多(表2)。T-bet在CHB肝組織的表達亦隨著CD4陽性細胞數(shù)的增多而增多，兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.938，P<0.01)。

表2 CHB不同分級分期中CD4表達水平的比較

3 討論

T-bet最初從Th1 cDNA文庫中分離得到，能與Th1特異的探針雜交，在向Th1細胞發(fā)育分化的早期T細胞中誘導(dǎo)T-bet表達。T-bet和GATA-3是Th1型細胞和Th2型細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子。目前，T-bet與CHB的發(fā)病機制的關(guān)系尚不完全清楚，且大多是通過外周血標本來觀察研究。本實驗通過肝組織穿刺標本觀察T-bet在肝臟中的表達，分析T-bet與CHB病變中炎癥和纖維化的關(guān)系。該方法的特點是在組織原位直接觀察T-bet在CHB病變組織中的分布，通過形態(tài)學(xué)可視化的方法闡述T-bet與CHB病變的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)：在CHB肝組織中，T-bet呈散在或聚集分布，且絕大部分T-bet分布在匯管區(qū)、界板、橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)；小葉中有少量表達，大多散在分布，也有一些灶性的表達方式。當機體感染HBV后與T-bet相關(guān)的免疫應(yīng)答先在匯管區(qū)開始，而后隨著病變的加重，逐步從界板炎到橋接壞死和融合壞死發(fā)展。這可能是由于CHB炎癥活動初期，大量的HBV特異性T細胞首先浸潤于匯管區(qū)，然后隨著疾病的發(fā)展逐漸破壞界板，形成橋接壞死區(qū)和融合壞死區(qū)。

①②③④⑤⑥

本研究發(fā)現(xiàn)，T-bet在CHB肝組織中的表達隨著CD4細胞數(shù)量的增多而增多，兩者呈顯著正相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在急性HBV感染中T-bet在CD8+T細胞中的表達水平增加，而長期慢性感染期間T-bet在CD8+T細胞中的表達喪失[7]。也就是說，CHB肝組織中表達T-bet的細胞可能以Th1型CD4+T淋巴細胞居多，因此T-bet表達隨著CD4+細胞的增多而增多。當然，不可否認T-bet在眾多免疫細胞中廣泛表達[8]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著CHB炎癥逐漸加重，T-bet在肝匯管區(qū)內(nèi)的表達逐漸增多，而且隨著病變程度加重，T-bet陽性細胞分布范圍擴大?？赡艿臋C制:當機體感染HBV后，病毒作用于單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞等分泌細胞因子IL-12，IL-12誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生，并促進Th0型細胞增殖分化成Th1型細胞，IFN-γ通過STAT1誘導(dǎo)T-bet表達，T-bet反過來又可誘導(dǎo)IFN-γ和IL-12Rβ2表達，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán),協(xié)同促進Th1型細胞增殖[9-10]。

此外，T-bet激活除了與CD11a的表達增加有關(guān)外，還與促P-選擇素和P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL1)糖基化結(jié)合酶的表達相關(guān)，該特性是T細胞黏附發(fā)炎內(nèi)皮細胞和遷移到炎癥部位的必要條件。同時，T-bet直接激活Th1型細胞特異性基因，包括一些細胞因子和趨化因子，遷移并招募其他免疫細胞到炎癥部位，從而控制局部組織的感染[11]。本實驗顯示CHB中絕大部分T-bet陽性細胞分布在匯管區(qū)及壞死區(qū)的炎性病變區(qū)，說明T-bet陽性T細胞最先通過血液循環(huán)被運輸?shù)皆搮^(qū)域，并發(fā)揮相應(yīng)的免疫應(yīng)答。

CHB的炎癥分級和纖維化分期常同步發(fā)展，但也有不一致的情況。實驗發(fā)現(xiàn)，T-bet在CHB肝組織的表達隨著纖維化程度加重而增多，這可能是由于本實驗納入病例的炎癥分級和纖維化分期同步發(fā)展而造成。

總之，本組通過免疫組化法檢測T-bet表達與CHB炎癥活動度、纖維化程度以及CD4細胞數(shù)呈正相關(guān)，提示其在CHB病變的發(fā)展以及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用。