朱劍軍，吳 昊

結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均高居消化系統(tǒng)惡性腫瘤首位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因參與、多步驟的癌變過程。近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道組胺與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。組胺能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性，提示組胺能夠作為一種潛在的抗癌佐劑，提高腫瘤患者的放療效果[2]。作為一種具有生理活性的小分子物質(zhì)，組胺通過與組胺受體結(jié)合，傳遞信號(hào)，在不同類型細(xì)胞中發(fā)揮不用作用[2]。組胺激活組胺1型受體，促進(jìn)細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和腫瘤生長[4]。激活組胺1型受體和組胺4型受體活性能夠顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性[2]，提示組胺受體蛋白家族可能是治療惡性腫瘤的一組潛在作用靶點(diǎn)。組胺受體3(histamine receptor 3, HRH3)是一種7次跨膜蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族[5]。HRH3基因定位于染色體20q13.3，蛋白質(zhì)由445個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為48.6 KD。有研究報(bào)道HRH3與肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移有關(guān)[5-7]。但截至目前，關(guān)于HRH3在結(jié)腸癌生長過程中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染siRNA片段的方式靶向沉默HRH3基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，CCK-8和EdU法監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞生長和增殖活性，qRT-PCR和Western blot法分析相關(guān)信號(hào)通路改變，明確HRH3基因在結(jié)腸癌細(xì)胞惡性增殖過程中的功能作用，探討相關(guān)分子機(jī)制，從而為闡明結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為結(jié)腸癌治療提供潛在作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone公司，美國)，CCK-8(碧云天公司，中國)，EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(銳博公司，中國),Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent(Invitrogen，美國)，cDNA合成試劑盒、TB Green Advantage qPCR Premix(Takara公司，日本)，HRH3抗體、c-Myc抗體和CDKN1A抗體(Abcam公司，美國)，β-actin抗體、二抗(三鷹公司，中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌Ls174T細(xì)胞和SW480細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板。24 h后，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。本課題實(shí)驗(yàn)分3組：空白對(duì)照組(只加Lipofectamine)、陰性對(duì)照組(si-NC組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA片段)、si-HRH3組(轉(zhuǎn)染si-HRH3片段)。si-HRH3片段正義鏈序列5′-GGAGGAGAAAUGUGC ACUCAU-3′，反義鏈序列3′-CCUCCUCUUUACACGU GAGUA-5′。siRNA片段和陰性對(duì)照序列由上海吉碼公司合成。

1.4 qRT-PCR常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA片段48 h后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。提取RNA、cDNA第一條鏈的合成步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。采用TB Green qPCR Premix完成PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。溶解曲線條件按照常規(guī)程序進(jìn)行。采用2-△△Ct算法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。HRH3引物、c-Myc引物和CDKN1A引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 Western blot常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA片段72 h后進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。后續(xù)按照常規(guī)步驟進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。常溫封閉1 h后，一抗孵育過夜。TBST沖洗后，二抗常溫孵育1 h。ECL發(fā)光液檢測(cè)蛋白條帶。HRH3和CDKN1A抗體工作濃度1∶1 000；c-Myc抗體工作濃度1∶2 000；二抗工作濃度1∶10 000。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染siRNA片段6 h后將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。接種時(shí)間記為0 h。在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的生長狀態(tài)。CCK-8溶液孵育1 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)。

1.7 EdU實(shí)驗(yàn)常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染siRNA片段48 h后進(jìn)行EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。加入適量EdU工作液，孵育2 h。后續(xù)經(jīng)多聚甲醛固定、沖洗、EdU反應(yīng)、Hoechst染色等步驟完成實(shí)驗(yàn)。最后用倒置熒光顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中HRH3表達(dá)的影響采用轉(zhuǎn)染siRNA片段的方法沉默HRH3基因表達(dá)。在結(jié)腸癌Ls174T和SW480細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段48 h后，si-HRH3組HRH3 mRNA表達(dá)水平降低，分別為82%±4.10%和75%±2.33%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01，圖1)。與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組HRH3 mRNA表達(dá)無顯著變化(P>0.05)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段72 h后，Ls174T和SW480細(xì)胞中HRH3蛋白水平均顯著降低(圖2)。上述研究表明，轉(zhuǎn)染si-HRH3能夠顯著沉默結(jié)腸癌細(xì)胞中HRH3表達(dá)水平。

圖1 轉(zhuǎn)染si-HRH3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中HRH3 mRNA表達(dá)水平的影響：A.Ls174T細(xì)胞；B.SW480細(xì)胞；**P<0.01

圖2 轉(zhuǎn)染si-HRH3對(duì)HRH3蛋白表達(dá)水平的影響：**P<0.01

2.2 HRH3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響為研究HRH3表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響，本實(shí)驗(yàn)首先通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默HRH3后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示，在Ls174T和SW480細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染si-HRH3片段后96 h，si-HRH3組細(xì)胞生長抑制率分別為39.00%±2.25%和35.54%±3.51%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01，圖3)。沉默HRH3后，結(jié)腸癌Ls174T和SW480細(xì)胞的生長明顯減慢。為進(jìn)一步驗(yàn)證HRH3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)采用EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，在Ls174T細(xì)胞中，陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖率為52.68%±1.33%，si-HRH3組細(xì)胞增殖率為23.11%±0.89%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。在SW480細(xì)胞中，陰性對(duì)照組與si-HRH3組的細(xì)胞增殖率分別為53.69%±2.57%、17.14%±1.46%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默HRH3表達(dá)能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性生長。

圖3 沉默HRH3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響：A.Ls174T細(xì)胞；B.SW480細(xì)胞；**P<0.01

2.3 沉默HRH3對(duì)細(xì)胞增殖關(guān)鍵分子表達(dá)水平的影響為深入研究沉默HRH3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的具體分子作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)沉默HRH3后c-Myc和CDKN1A的表達(dá)水平。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ls174T和SW480細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，si-HRH3組c-Myc mRNA表達(dá)水平均顯著降低，分別為35.11%±1.52%和24.65%±1.80%，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025，P=0.030)；與陰性對(duì)照組相比，si-HRH3組CDKN1A mRNA表達(dá)水平顯著升高，分別為56.73%±1.44%和55.39%±3.14%，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0093，P=0.015，圖5)。與qRT-PCR結(jié)果一致，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默HRH3后，c-Myc蛋白水平降低(P<0.01)，CDKN1A蛋白水平升高(P<0.01，圖6)。上述研究結(jié)果表明，HRH3可能通過調(diào)控c-Myc和CDKN1A表達(dá)水平，影響結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性增殖。

圖4 沉默HRH3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響：A.Ls174T細(xì)胞；B.SW480細(xì)胞

圖5 沉默HRH3對(duì)c-Myc和CDKN1A mRNA表達(dá)的影響：A.Ls174T細(xì)胞中c-Myc mRNA的表達(dá)；B.SW480細(xì)胞中c-Myc mRNA的表達(dá)；C.Ls174T細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)；D.SW480細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01

圖6 沉默HRH3對(duì)c-Myc和CDKN1A蛋白水平的影響**P<0.01

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，2018年全球新增結(jié)腸癌109萬余例，新增死亡55萬余例，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤第三位，病死率高居所有惡性腫瘤第二位[1]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)[8]。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和其它非細(xì)胞成分(包括細(xì)胞因子、趨化因子等生理活性物質(zhì))共同組成[8]。組胺作為腫瘤環(huán)境中的重要一員，由組氨酸脫氫酶催化L-組氨酸脫羧形成，主要儲(chǔ)存于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞[3]。近年來，越來越多的研究證實(shí)，組胺和組胺受體在炎癥和惡性腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用[9]。

HRH3表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5,7]。Lin等[7]報(bào)道HRH3在惡性膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，抑制HRH3能夠顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，抑制HRH3后前列腺癌的生長能力和侵襲活性減弱，細(xì)胞凋亡增加。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HRH3在肝細(xì)胞肝癌中呈顯著高表達(dá)，且激活HRH3后，肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著升高[5]。與上述報(bào)道一致，本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染siRNA片段沉默HRH3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，沉默HRH3后結(jié)腸癌細(xì)胞生長減慢，細(xì)胞增殖活性顯著降低，提示HRH3在結(jié)腸癌的發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮促癌作用。然而，F(xiàn)rancis等[10]在膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，HRH3激動(dòng)劑能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞生長，提示HRH3在膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用?；诖?，作者推測(cè)HRH3在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮不同作用，其作用機(jī)制有待深入研究。

目前，HRH3促進(jìn)惡性腫瘤增殖和遷移的作用機(jī)制尚未完全闡明。Lin等[7]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)，HRH3通過調(diào)控PI3K/Akt和MEK/ERK信號(hào)通路，影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的表達(dá)，如E-cadherin、ZO-1、vimentin和N-cadherin等，進(jìn)而促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Francis等[10]報(bào)道，HRH3通過調(diào)控PKCα依賴的ERK1/2去磷酸化抑制膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞生長，提示ERK信號(hào)通路參與HRH3介導(dǎo)的膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞生長。PI3K/Akt、MEK/ERK等信號(hào)通路通過激活下游靶基因，如c-Myc、CDKN1A等，在促進(jìn)細(xì)胞生存和細(xì)胞周期進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用[11-14]。c-Myc在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，且c-Myc表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞惡性增殖活性密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默HRH3后c-Myc的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，沉默HRH3后，c-Myc mRNA和蛋白水平均顯著降低，提示HRH3可能通過激活c-Myc信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生長。

細(xì)胞周期失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖的一個(gè)重要始動(dòng)因素[16]。Bai等[11]報(bào)道Akt通過調(diào)控CDK抑制因子CDKN1A，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默HRH3后，CDKN1A mRNA和蛋白水平均顯著升高，提示HRH3可能通過調(diào)控CDKN1A表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，最終促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性增殖。然而，HRH3也能通過調(diào)控其它信號(hào)途徑影響腫瘤細(xì)胞生存[6]。例如，Chen等[6]在前列腺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，敲除HRH3后，雄激素受體(androgen receptor, AR)表達(dá)水平降低，提示HRH3可能通過AR途徑抑制前列腺癌細(xì)胞生長、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果提示HRH3可能通過激活不同信號(hào)通路，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。

綜上所述，沉默HRH3表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性減弱，c-Myc表達(dá)降低，CDKN1A表達(dá)升高?；诖耍茰y(cè)HRH3可能通過調(diào)控c-Myc和CDKN1A轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性增殖。但是，HRH3是如何調(diào)控c-Myc和CDKN1A表達(dá)，PI3K/Akt、MAPK/ERK等信號(hào)途徑在HRH3介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮怎樣的作用，這些問題有待進(jìn)一步深入探討。