沈 成，楊年釗，王明海，劉銀華，吳立勝，朱志強(qiáng)

胃癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率在我國(guó)消化系統(tǒng)的腫瘤中居首位。盡管目前胃癌在臨床和實(shí)驗(yàn)方面已有大量的研究，但近年來(lái)中晚期胃癌患者的5年生存率并未明顯的改善。5-甲基胞嘧啶(M5C)RNA甲基化修飾是RNA轉(zhuǎn)錄后的一種RNA修飾，已經(jīng)證實(shí)tRNA、rRNA和mRNA中存在這種修飾[1]。甲基化后的胞嘧啶序列仍然保持相同，但發(fā)生甲基化基因的表達(dá)可能發(fā)生顯著變化。目前發(fā)現(xiàn)的M5C位點(diǎn)主要使用高通量技術(shù)結(jié)合下一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)來(lái)證實(shí)[2]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究了M5C在mRNA上的分布特征[3]。NSUN2(NOP2/Sun domain family member 2)作為mRNA上的M5C催化酶和結(jié)合酶，在mRNA、tRNA和microRNA的甲基化修飾中發(fā)揮了重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。已發(fā)現(xiàn)NSUN2在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[6]和食管鱗狀細(xì)胞癌[7]等惡性腫瘤中的表達(dá)上升，但目前關(guān)于NSUN2與胃癌的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、qRT-PCR及Western blot法檢測(cè)NSUN2的mRNA和蛋白在胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異，分析胃癌中NUSN2表達(dá)與臨床病理特征以及術(shù)后生存時(shí)間的相關(guān)性并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2010年1月～2014年12月皖南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科行胃癌根治術(shù)(D2/D3切除)并達(dá)到R0切除的手術(shù)標(biāo)本109例，其中男性69例，女性40例，以患者年齡和腫瘤直徑的平均值界定分組標(biāo)準(zhǔn)。另取距離腫瘤≥5 cm的對(duì)應(yīng)正常胃組織作為對(duì)照。TNM分期按照AJCC第7版分期進(jìn)行[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意并批準(zhǔn)對(duì)109例患者的生存時(shí)間進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，記錄總生存時(shí)間(overall survival, OS)和無(wú)瘤生存時(shí)間(disease-free survival, DFS)，失聯(lián)患者定義為刪失數(shù)據(jù)。在手術(shù)標(biāo)本中隨機(jī)挑選20例新鮮胃癌和對(duì)應(yīng)正常胃組織(-80 ℃低溫冰箱中保存)，用于qRT-PCR和Western blot檢測(cè)。

1.2 主要試劑BCA試劑盒裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，DAB顯色試劑盒、免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司；NSUN2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，蘇木精染色劑購(gòu)自中國(guó)貝索生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 免疫組化采用SP法，所有標(biāo)本經(jīng)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水檸檬酸緩沖液中孵育20 min后放入3%H2O2中10 min，加入一抗NSUN2(1∶100)4 ℃過(guò)夜后用二抗孵育30 min，加DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，風(fēng)干后鏡檢拍照記錄。每例切片均由三位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。NSUN2陽(yáng)性定位位于細(xì)胞核，結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[9]，根據(jù)陽(yáng)性著色百分比和染色強(qiáng)度綜合評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，>50%為3分；無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：<5分為低表達(dá)，≥5分為高表達(dá)。

1.3.2qRT-PCR Trizol試劑盒提取胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性；5 s后控溫60 ℃退火30 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。NSUN2上游引物5′-GAACTTGCCTG GCACACAAAT-3′，下游引物5′-TGCTAACAGCTTCT TGACGACTA-3′；β-actin上游引物5′-AGCGAGCAT CCCCCAAAGTT-3′，下游引物5′-GGGCACGAAGGC TCATCATT-3′。NSUN2與β-actin內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)副孔，用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量[9]。

1.3.3Western blot 將胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織充分研磨后加入裂解液和蛋白酶抑制劑，使用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，加入緩沖液煮沸變性蛋白。配制10%的SDS-PAGE，上樣蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜，加入一抗NSUN2和β-actin(NSUN2 1∶500，β-actin 1∶1 000)4 ℃孵育12 h。加入二抗(1∶5 000)常溫孵育60 min。Alpha-Ease FC成像系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Alpha Innotech公司)觀察。分析NSUN2蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值用于分析NSUN2蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中NUSN2的表達(dá)NUSN2主要定位于細(xì)胞核中，109例胃癌組織中NUSN2高表達(dá)率為65.1%(71/109)，而癌旁組織高表達(dá)率為15.6%(17/109)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

AB

2.2 胃癌中NUSN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系NUSN2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、臨床分級(jí)、TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤位置和直徑無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

2.3 胃癌中NUSN2表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示胃癌中NSUN2高表達(dá)患者的OS低于NSUN2低表達(dá)患者(P=0.009，圖2)，NSUN2高表達(dá)患者的DFS也低于NSUN2低表達(dá)患者(P=0.001，圖3)。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)NSUN2 mRNA水平qRT-PCR檢測(cè)NSUN2 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，20對(duì)標(biāo)本中有17對(duì)(85%)胃癌組織NSUN2 mRNA的表達(dá)顯著升高。定量結(jié)果表明，NSUN2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在胃癌組織中為0.99±0.52，在癌旁組織中為0.27±0.50，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.528，P<0.05，圖4)。

2.5 Western blot法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中NSUN2的表達(dá)與癌旁組織相比，20對(duì)胃癌標(biāo)本中有16對(duì)(80%)的NSUN2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖5)。定量結(jié)果顯示，NSUN2蛋白的相對(duì)表達(dá)量在胃癌組織中為1.24±0.36，癌旁組織中為0.69±0.29，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.363，P<0.05)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是由遺傳基因改變和表觀遺傳學(xué)改變共同決定的。胃癌的遺傳基因常發(fā)生改變，例如p53、KRAS、PIK3CA、ARID1A、MLL3和MLL突變，以及PIK3CA、C-MET、ERBB4和CD44擴(kuò)增，提示它們可能是關(guān)鍵的致癌原因，在胃癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[10-14]。除遺傳基因改變以外，表觀遺傳學(xué)的改變，包括DNA甲基化、組蛋白的翻譯后修飾、RNA轉(zhuǎn)錄后修飾等也參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。NSUN2作為mRNA上的M5C催化酶和結(jié)合酶與人類癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。Tang等[15]在研究復(fù)制性衰老過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)控制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶p27KIP1在其mRNA上的5′Untranslated Region(5′UTR)發(fā)生M5C甲基化修飾，并且M5C的甲基化在細(xì)胞衰老過(guò)程中逐漸喪失，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2過(guò)表達(dá)能抑制p27KIP1表達(dá)，而NSUN2敲低后p27KIP1表達(dá)升高，這表明NSUN2通過(guò)M5C甲基化修飾抑制p27KIP1翻譯。相反，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK1和p21的3′UTR中發(fā)生M5C甲基化修飾后，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)會(huì)促進(jìn)mRNA的翻譯。Alshaker等[16]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中NSUN2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平提高，而正常乳腺上皮細(xì)胞和組織中NSUN2的表達(dá)水平偏低。敲低NSUN2基因后乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力下降，過(guò)表達(dá)NSUN2基因后乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移能力增強(qiáng)[17]。進(jìn)一步研究NSUN2基因的作用機(jī)制，DNA低甲基化過(guò)表達(dá)NSUN2基因并活化原癌基因MYC，然后NSUN2作為活化的MYC靶基因，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[18]。Yang等[19]在對(duì)膽囊癌的研究發(fā)現(xiàn)NSUN2在正常膽囊組織中低表達(dá)，在膽囊癌細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)NSUN2過(guò)表達(dá)下調(diào)核糖體蛋白L6(RPL6)的表達(dá)，RPL6低表達(dá)減弱了DNA損傷檢查點(diǎn)1(MDC1)和H2A組蛋白家族成員X的介體(γH2AX)之間的相互作用，抑制了腫瘤蛋白p53結(jié)合蛋白1(TP53BP1)和DNA修復(fù)相關(guān)蛋白(BRCA1)的表達(dá)。RPL6敲低減弱DNA損傷修復(fù)，適當(dāng)?shù)腄NA損傷修復(fù)對(duì)于預(yù)防腫瘤發(fā)生至關(guān)重要[19]。綜上所述，NSUN2參與了多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

表1 胃癌中NSUN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 胃癌中NSUN2表達(dá)與患者總生存時(shí)間關(guān)系

圖3 胃癌中NSUN2表達(dá)與患者無(wú)瘤生存時(shí)間的關(guān)系

圖4 qRT-PCR檢測(cè)胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中NSUN2 mRNA的表達(dá)

圖5 Western blot法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中NSUN2的表達(dá)：T.胃癌組織；N.癌旁組織

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)NSUN2在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析NSUN2表達(dá)與胃癌臨床病理特征以及患者預(yù)后的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中免疫組化、Western blot及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示與癌旁組織相比，胃癌組織中NSUN2表達(dá)量明顯上升，NSUN2表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)侵犯、臨床分級(jí)、TNM分期密切有關(guān)；與患者年齡、性別、腫瘤位置及直徑無(wú)顯著相關(guān)性。生存分析顯示NSUN2高表達(dá)患者術(shù)后的OS和DFS明顯下降，這表明NSUN2表達(dá)與胃癌的增殖和侵襲能力相關(guān)，NSUN2高表達(dá)多提示胃癌較高的惡性程度及更差的預(yù)后。qRT-PCR及Western blot法從轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平證實(shí)NSUN2基因在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)差異，揭示了NSUN2基因可能在轉(zhuǎn)錄后以及蛋白翻譯過(guò)程中影響胃癌的發(fā)展?？傊緦?shí)驗(yàn)結(jié)果提示NSUN2表達(dá)與胃癌TNM分期和侵襲性顯著相關(guān)，NSUN2表達(dá)影響患者預(yù)后，通過(guò)檢測(cè)NSUN2表達(dá)可以評(píng)判胃癌患者病情和預(yù)后，未來(lái)有希望以調(diào)控NSUN2表達(dá)為靶點(diǎn)干預(yù)胃癌的發(fā)展進(jìn)程和患者的預(yù)后。

本實(shí)驗(yàn)作為單中心小樣本的回顧性分析，不可避免的具有一定的選擇偏倚，并且缺少體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，因此有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和深入的作用機(jī)制研究。總之，對(duì)NSUN2在胃癌中的工作靶點(diǎn)及具體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行基因?qū)用嫔系纳钊胙芯繉?duì)臨床上胃癌的治療有重要意義，可以為胃癌診斷和治療提供新思路。