廉 潔，南鵬飛，張冠軍，張 昀

胃腺癌是全球最常見(jiàn)且是一類分子水平高度異質(zhì)的惡性腫瘤。因此有必要對(duì)胃腺癌患者相關(guān)分子靶向檢測(cè)指導(dǎo)下的個(gè)體化治療進(jìn)行更深入的研究。許多研究已證實(shí)在惡性腫瘤組織中免疫系統(tǒng)可以通過(guò)“免疫調(diào)節(jié)”來(lái)發(fā)揮作用，文獻(xiàn)報(bào)道PD-1/PD-L1相關(guān)的免疫治療靶點(diǎn)在胃腺癌的治療中可以獲益[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)PD-L1相關(guān)的免疫治療或許可以加強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的清除作用。PD-L1是PD-1的配體，在許多惡性腫瘤中均有表達(dá)，可以抑制細(xì)胞因子的分泌和PD-1陽(yáng)性腫瘤相關(guān)的CD4+和CD8+細(xì)胞的溶解活性[2]，這些屬性使得PD-L1可能成為多種惡性腫瘤免疫治療新的靶點(diǎn)。HER-2是目前胃癌中研究最多的靶向治療的靶點(diǎn)，隨著對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的不斷認(rèn)識(shí)，PD-L1相關(guān)的免疫治療與抗HER-2的靶向治療是否可以共同參與胃腺癌患者的治療，兩者之間是否有一定的關(guān)系尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)探索胃腺癌中PD-L1的表達(dá)，分析PD-L1與HER-2表達(dá)的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2010～2015年存檔的臨床病理資料完整的胃腺癌手術(shù)標(biāo)本75例，患者術(shù)前均未行放、化療治療。對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式包括電話、再次住院病歷調(diào)查。隨訪期間內(nèi)75例胃腺癌患者中存活40例，死亡35例，中位生存時(shí)間71個(gè)月；從死亡原因看，轉(zhuǎn)移至肝臟15例，轉(zhuǎn)移至肺10例，轉(zhuǎn)移至骨4例，原部位復(fù)發(fā)6例。

1.2 方法所有石蠟組織塊4 μm厚切片，PD-L1(Abcam公司，克隆號(hào)ab58810)、D2-40、S-100檢測(cè)采用免疫組化MaxVision快捷法：采用檸檬酸抗原熱修復(fù)，PD-L1采用正常扁桃體組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。HER-2檢測(cè)參照《胃癌HER-2檢測(cè)指南》檢測(cè)流程先將所有腫瘤切片行免疫組化檢測(cè)，將HER-2 2+病例行FISH檢測(cè)[3]。

1.3 結(jié)果判定所有免疫組化結(jié)果均由三位高年資病理醫(yī)師進(jìn)行閱片，PD-L1陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，細(xì)顆粒狀。PD-L1判讀標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)PD-L1 TPS計(jì)數(shù)方法，腫瘤細(xì)胞膜染色≥1%視為陽(yáng)性，總陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)>5%視為PD-L1陽(yáng)性。HER-2檢測(cè)結(jié)果：將免疫組化0、1+及2+行FISH檢測(cè)結(jié)果為未擴(kuò)增的病例判定為HER-2無(wú)過(guò)表達(dá)，將免疫組化3+及免疫組化2+并FISH檢測(cè)結(jié)果為擴(kuò)增的病例判定為HER-2過(guò)表達(dá)。HER-2判讀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《胃癌HER-2檢測(cè)指南》，將免疫組化為無(wú)反應(yīng)、<10%腫瘤細(xì)胞膜染色判定為0，≥10%的腫瘤細(xì)胞微弱或隱約可見(jiàn)膜染色或僅有部分細(xì)胞膜染色判定為1+，≥10%的腫瘤細(xì)胞有弱到中等強(qiáng)度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜染色判定為2+，≥10%的腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性膜強(qiáng)染色判定為3+[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間對(duì)比及HER-2和PD-L1陽(yáng)性率與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系分別采用χ2和Fisher精確檢驗(yàn)，兩者之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier進(jìn)行單因素生存分析，行Log-rank檢驗(yàn)，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征在75例胃腺癌中，男性63例，女性12例；年齡31～86歲，平均62歲；腫瘤位于胃食管交界部23例，胃體部19例，幽門部31例，彌漫型2例；腫瘤直徑>3 cm的56例，≤3 cm的19例；Borrmann分型：結(jié)節(jié)型6例，潰瘍局限型50例，浸潤(rùn)潰瘍型16例，彌漫浸潤(rùn)型3例；浸潤(rùn)深度T1期2例，T2期11例，T3期25例，T4期37例；組織學(xué)WHO分型：乳頭狀型2例，管狀型67例，黏液型5例，低黏附型1例；Lauren分型：彌漫型35例，腸型40例；高分化6例，中分化40例，低分化29例；有脈管浸潤(rùn)者38例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；神經(jīng)浸潤(rùn)27例；有腫瘤出芽者67例；腫瘤出芽數(shù)目≤10個(gè)/20 HPF 30例，>10個(gè)/20 HPF 45例。

2.2 胃腺癌組織中PD-L1及HER-2的表達(dá)本組75例胃腺癌中，PD-L1陽(yáng)性43例，陽(yáng)性率為57.3%；對(duì)HER-2行免疫組化染色并對(duì)HER-2 2+者進(jìn)行FISH檢測(cè)，結(jié)果HER-2過(guò)表達(dá)例數(shù)占總數(shù)的17.3%(13/75)，無(wú)過(guò)表達(dá)例數(shù)占總數(shù)的82.7%(62/75)(圖1～3)。

2.3 胃腺癌中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PD-L1表達(dá)與胃腺癌患者年齡、性別、腫瘤部位、大小、浸潤(rùn)深度、Borrmann分型、組織學(xué)分型、神經(jīng)浸潤(rùn)、脈管浸潤(rùn)、Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有腫瘤出芽及出芽數(shù)量均無(wú)關(guān)(P>0.05)。僅與腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05，表1)，進(jìn)一步行Spearman相關(guān)性分析得出，PD-L1表達(dá)與分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.26，P<0.05)。

2.4 胃腺癌中HER-2和PD-L1表達(dá)的相關(guān)性75例進(jìn)展期胃腺癌中，13例HER-2過(guò)表達(dá)病例中有11例PD-L1陽(yáng)性，占HER-2過(guò)表達(dá)的85%。進(jìn)一步行Spearman相關(guān)性分析顯示：PD-L1表達(dá)與HER-2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.25，P=0.029)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 胃腺癌中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

①A①B①C①D②A②B③A③B

表2 胃腺癌中PD-L1與HER-2表達(dá)的相關(guān)性

2.5 生存分析75例胃腺癌患者隨訪1～123個(gè)月，中位隨訪時(shí)間48個(gè)月，3年生存率為61%，5年生存率為52%，中位生存時(shí)間71個(gè)月。單因素分析結(jié)果顯示：浸潤(rùn)深度(P=0.006)、脈管浸潤(rùn)(P=0.03)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)、HER-2表達(dá)(P=0.02)、腫瘤出芽數(shù)>10個(gè)/20 HPF(P=0.001)是影響胃腺癌患者預(yù)后的因素(圖4)?；颊咝詣e、年齡、腫瘤部位、分化程度、大小、Borrmann分型、組織學(xué)分型、Lauren分型、神經(jīng)浸潤(rùn)、PD-L1表達(dá)與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。HER-2過(guò)表達(dá)組患者的5年累積生存率低于無(wú)HER-2過(guò)表達(dá)組(P=0.02)；PD-L1陽(yáng)性組患者的5年累積生存率低于陰性組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。分析胃腺癌中HER-2和PD-L1表達(dá)的關(guān)系對(duì)胃腺癌患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：不同的HER-2和PD-L1表達(dá)組之間，其胃腺癌患者的預(yù)后存在差異：HER-2過(guò)表達(dá)PD-L1陽(yáng)性組的5年生存率最低，其次是HER-2過(guò)表達(dá)PD-L1陰性組及HER-2無(wú)過(guò)表達(dá)PD-L1陽(yáng)性組，胃腺癌患者的5年生存率最高為HER-2無(wú)過(guò)表達(dá)PD-L1陰性組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03，表3，圖4)。

表3 HER-2及PD-L1的單因素預(yù)后分析

圖4 單因素分析各因素的Kaplan-Meier生存曲線：A.浸潤(rùn)深度；B.PD-L1表達(dá)；C.脈管浸潤(rùn)；D.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；E.HER-2表達(dá)狀態(tài)；F.不同HER-2及PD-L1表達(dá)組；G.腫瘤出芽數(shù)目

2.5 影響預(yù)后的多因素Cox分析對(duì)所有單因素分析中與預(yù)后有影響的危險(xiǎn)因素進(jìn)行Cox逐步回歸分析，結(jié)果顯示僅HER-2表達(dá)是影響胃腺癌患者生存期的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05，表4)。

表4 影響胃癌預(yù)后的多因素Cox分析

3 討論

腫瘤細(xì)胞若要維持增長(zhǎng)就必須要逃避或抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤組織的攻擊，而機(jī)體對(duì)抗腫瘤的免疫應(yīng)答主要是T細(xì)胞免疫應(yīng)答，T細(xì)胞在活化的過(guò)程中需要APCs-MHC-多肽復(fù)合體與T細(xì)胞受體之間的作用，還需要共刺激分子的輔助。PD-L1作為負(fù)性刺激家族-B7家族中的一員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用，它與腫瘤發(fā)生之間可能存在的機(jī)制如下：首先，PD-L1陽(yáng)性的腫瘤組織對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)降低，并且T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)遭到抑制；再次，腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)可以導(dǎo)致特異性CD8+陽(yáng)性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致癌組織對(duì)機(jī)體的免疫逃逸反應(yīng)的發(fā)生[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、分化程度、腫瘤部位相關(guān)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)PD-L1表達(dá)僅與腫瘤分化程度有關(guān)，經(jīng)進(jìn)一步Spearman分析發(fā)現(xiàn)，分化程度越低的胃腺癌組織PD-L1陽(yáng)性率越高，說(shuō)明PD-L1表達(dá)與胃腺癌惡性程度有關(guān)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1與許多腫瘤的預(yù)后有關(guān)，例如，腎臟惡性腫瘤中PD-L1高表達(dá)意味著腫瘤進(jìn)展速度快且病死率高；在術(shù)后復(fù)發(fā)的泌尿道上皮腫瘤中也發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)；在胰腺癌中PD-L1陽(yáng)性患者的生存率低于陰性患者。目前，PD-L1對(duì)胃腺癌預(yù)后的影響尚不十分明了，研究證實(shí)，胃腺癌中PD-L1表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[7]。目前文獻(xiàn)報(bào)道胃腺癌中PD-L1的陽(yáng)性率并沒(méi)有明確的范圍，Wu等[8]的研究中PD-L1在胃腺癌中的陽(yáng)性率約為42.2%，Jiang等[9]的研究中PD-L1在胃腺癌中的陽(yáng)性率為43%。可以看出，PD-L1在胃腺癌中的陽(yáng)性率偏高。同時(shí)，Wu等[8]在其研究中還發(fā)現(xiàn)生存期小于2年的胃腺癌中PD-L1陽(yáng)性率為59%，明顯高于生存期大于5年的胃腺癌患者(25.5%)。本實(shí)驗(yàn)中，75例胃腺癌中43例PD-L1陽(yáng)性，陽(yáng)性率為57.3%，比文獻(xiàn)報(bào)道的PD-L1陽(yáng)性率略高，這可能與本組樣本量偏小有關(guān)，需在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量再加以驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行了術(shù)后5年以上的隨訪，結(jié)果顯示PD-L1陽(yáng)性病例的5年生存率為53%，低于PD-L1陰性組(59%)，這也提示PD-L1陽(yáng)性患者的預(yù)后較差，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本組樣本量偏少有關(guān)。

Suh等[10]提出在HER-2過(guò)表達(dá)的胃腺癌中PD-L1表達(dá)也相對(duì)高，在PD-L1陽(yáng)性胃腺癌組織中HER-2過(guò)表達(dá)約占33%，而在HER-2過(guò)表達(dá)胃腺癌組織中PD-L1陽(yáng)性率高達(dá)84%。這與本實(shí)驗(yàn)中PD-L1陽(yáng)性中HER-2過(guò)表達(dá)占26%，HER-2過(guò)表達(dá)組中PD-L1陽(yáng)性占85%的結(jié)果基本一致，且單因素分析顯示當(dāng)HER-2過(guò)表達(dá)PD-L1陽(yáng)性時(shí)，患者的5年生存率最低，而HER-2無(wú)過(guò)表達(dá)PD-L1陰性時(shí)，患者的5年生存率最高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織中HER-2表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.25，P<0.05)，在胃腺癌組織中HER-2過(guò)表達(dá)率越高，PD-L1陽(yáng)性率也隨之升高。這可能反應(yīng)了兩者共同參與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。提示同時(shí)進(jìn)行抗HER-2及抗PD-L1治療或許可以提高胃腺癌患者的治療效果。

現(xiàn)今，有研究表明T細(xì)胞依賴的雙特異性抗體(T-cell-dependent bispecific antibodies, TDBs)可以激活腫瘤的T細(xì)胞效應(yīng)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，同時(shí)可以與HER-2結(jié)合。但是同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，若腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)PD-L1則TDBs的抗腫瘤效應(yīng)大大減弱，使用PD-L1抑制劑這種抑制效應(yīng)則消失。聯(lián)合使用HER-2和PD-L1的治療或許可以延緩腫瘤的進(jìn)展過(guò)程[11-13]。胃腺癌治療中兩者可能的作用機(jī)制為：(1)抗PD-L1治療可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的逃逸作用，加強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性殺傷作用，從而間接的加強(qiáng)了曲妥珠單抗對(duì)胃癌細(xì)胞的靶向清除作用；(2)抗HER-2靶向治療可以通過(guò)打破胃癌原癌基因的“成癮性”來(lái)加強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而引起胃癌細(xì)胞的衰老并促進(jìn)T細(xì)胞的免疫清除效應(yīng)。因此，抗PD-L1治療可以鞏固曲妥珠單抗的治療效果，使得曲妥珠單抗對(duì)胃腺癌的殺傷性可以持續(xù)存在，聯(lián)合使用抗HER-2和抗PD-L1治療，或許可以延緩腫瘤的進(jìn)展過(guò)程[14-15]。然而，僅通過(guò)本實(shí)驗(yàn)還不能明確兩者作用于進(jìn)展期胃癌具體的作用機(jī)制，仍需我們進(jìn)一步進(jìn)行更深層次的研究。