王固兵，徐秀林，胡秀枋，郭宛星

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

1 引 言

癌癥已成為全球首要的疾病死亡原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有760萬(wàn)人死于癌癥，其中我國(guó)就有196萬(wàn)人，占全球癌癥死亡人數(shù)的25.89%[1]，因此，癌癥早期診斷對(duì)降低臨床死亡率、提高患者生存質(zhì)量有非常重要的意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，90%癌癥患者的死亡和腫瘤灶的轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，如果癌癥患者能在腫瘤灶轉(zhuǎn)移前得到診斷和治療，至少有30%的死亡是可以預(yù)防的[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞作為一種由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是癌癥發(fā)病或轉(zhuǎn)移的早期征兆，且血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量可用于預(yù)測(cè)癌癥患者的生存期[4]。此外，分析獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于癌癥早期篩查、診斷、療效評(píng)價(jià)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控，同時(shí)可為癌癥治療提供新的思路[5]。然而，循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血液中數(shù)量極其稀少(l mL血液中僅1～100個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞)[6]，因此如何從血液中快速分離稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞是進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞分析的重要前提。

隨著微流控技術(shù)的高速發(fā)展，使用微流控技術(shù)進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選日趨成熟，然而在利用微流控技術(shù)分選循環(huán)腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，驅(qū)動(dòng)血液樣品進(jìn)樣速度的大小對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果具有極其重要的影響，過(guò)大或過(guò)小的進(jìn)樣速度均會(huì)導(dǎo)致循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選率的降低。目前，微流控系統(tǒng)中使用微量注射泵、微量蠕動(dòng)泵進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)行驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣，其流量控制精度高且流量調(diào)節(jié)范圍較大，但由于均采用脈沖式驅(qū)動(dòng)的原理[7]，進(jìn)樣過(guò)程中均存在流量脈動(dòng)現(xiàn)象[8]，此外，注射器的自身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致注射器內(nèi)易殘留空氣且難以排空，在進(jìn)樣過(guò)程中存在死體積，嚴(yán)重影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果[9]。

本研究基于壓力泵驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的原理，設(shè)計(jì)了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選裝置的進(jìn)樣系統(tǒng)，通過(guò)精確控制氣體的壓力，確保進(jìn)樣過(guò)程中流量穩(wěn)定并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)反饋調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)的研發(fā)避免了蠕動(dòng)泵和注射泵進(jìn)樣系統(tǒng)中的流量脈動(dòng)和死體積現(xiàn)象，同時(shí)具有較高的流量控制精度和較廣的流量調(diào)節(jié)范圍，可為循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選率的提高提供技術(shù)保障。

2 壓力進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)計(jì)

本研究設(shè)計(jì)的進(jìn)樣系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)為: 進(jìn)樣速度30 mL/h，穩(wěn)定可靠，流量調(diào)節(jié)范圍為10～60 mL/h，驅(qū)動(dòng)氣體壓力范圍為0～1.2 bar。

該進(jìn)樣系統(tǒng)由壓力供給模塊、氣壓控制流量模塊、氣體壓力和液體流量信號(hào)采集模塊、上位機(jī)軟件等組成。壓力供給模塊能夠持續(xù)提供0～1.2 bar的穩(wěn)定壓強(qiáng)的氣壓；氣壓控制流量模塊能夠準(zhǔn)確的控制被測(cè)血細(xì)胞溶液在微流控芯片中的流量；氣壓和液體流量信號(hào)采集模塊能夠采集進(jìn)樣時(shí)的氣壓和液體流量信號(hào)上傳至上位機(jī)，并使用進(jìn)樣流量信號(hào)作為反饋量進(jìn)行閉環(huán)流量調(diào)節(jié)；上位機(jī)軟件能夠?qū)崿F(xiàn)進(jìn)樣過(guò)程中氣壓和流量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)通道、進(jìn)樣量、進(jìn)樣時(shí)間、進(jìn)樣速度的設(shè)置等功能。

控制系統(tǒng)采用上、下位機(jī)結(jié)構(gòu), 下位機(jī)采用STM32作為氣壓控制的核心，用于控制電壓信號(hào)的輸出以及壓力與流量信號(hào)的采集，上位機(jī)軟件采用Visual C++開(kāi)發(fā)，上下位機(jī)進(jìn)行串口通訊，由上位機(jī)控制下位機(jī)電壓信號(hào)的輸出，同時(shí)上位機(jī)還對(duì)采集到的液體壓力信號(hào)和流量信號(hào)進(jìn)行處理、分析和顯示。通過(guò)上位機(jī)軟件設(shè)定進(jìn)樣速度，全自動(dòng)的完成進(jìn)樣，且進(jìn)樣速度穩(wěn)定。系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)框圖見(jiàn)圖1，系統(tǒng)實(shí)物見(jiàn)圖2 。

圖1 壓力進(jìn)樣系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 The overall structure of the pressure injection system block diagram

圖2 壓力進(jìn)樣系統(tǒng)實(shí)物圖Fig.2 Pressure injection system physical diagram

2.1 進(jìn)樣系統(tǒng)分析

2.1.1壓力驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)設(shè)計(jì)原理 該系統(tǒng)采用氣壓驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)微流控芯片中的樣品液進(jìn)樣，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。工作原理是在密閉容器內(nèi)盛有一定量的樣品溶液，向密閉容器中通入一定壓力的氣體[10]，容器內(nèi)的液體在壓力的作用下沿著液體管道進(jìn)入微流控芯片，由微流控芯片完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選。進(jìn)樣速度與入口壓力成正比，對(duì)圖3所示的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，若不考慮液體的壓縮性，由液體的流量連續(xù)性方程得出：

(1)

假設(shè)樣品溶液在管道中做層流流動(dòng)，其流量計(jì)算公式為：

(2)

式中μ為血液粘度，d為液體管道的直徑，L0為液體管道的長(zhǎng)度，P0為內(nèi)充液的初始?jí)毫?，本系統(tǒng)中的μ為2.7 mpas，d為0.56 mm，L0為12 cm。由式(2)可知?dú)怏w驅(qū)動(dòng)壓力和進(jìn)樣流量之間的數(shù)據(jù)關(guān)系。

圖3 進(jìn)樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Injection system structure

2.1.2氣體壓力調(diào)節(jié) 該系統(tǒng)采用比例電磁閥(德國(guó)Tecno公司，型號(hào)PS120000-020-01)進(jìn)行壓力調(diào)節(jié)，其調(diào)壓精度為2 mbar，響應(yīng)時(shí)間為0.5 ms。采用氣壓泵(上海蓬普流體科技公司，型號(hào)GEB1298406)持續(xù)供氣，其最大輸出壓力為1.2 bar，氣體流量為8.2 L/min。

比例電磁閥的工作曲線見(jiàn)圖4。通過(guò)控制加在其控制端的電壓(0～10 V)控制比例電磁閥的開(kāi)度從而控制輸出壓力的大小，由圖4可知，比例電磁閥0～10 V對(duì)應(yīng)0～1 bar的壓力范圍，即0.01 V可調(diào)節(jié)1 mbar的壓力輸出，為滿足比例電磁閥1 mbar的壓力調(diào)節(jié)精度，需控制電路電壓輸出精度達(dá)到0.001 V，且穩(wěn)定在0.01 V，為了精確地控制密閉容器內(nèi)氣體的壓力，本研究設(shè)計(jì)了高精度電壓輸出電路，比例電磁閥配以比例-積分-微分控制器(PID)。

PID控制又稱PID調(diào)節(jié)，是根據(jù)系統(tǒng)的誤差，利用比例、積分、微分計(jì)算出輸入值，然后進(jìn)行控制[11]，把系統(tǒng)的輸出值作為反饋，與系統(tǒng)的給定值進(jìn)行運(yùn)算后，將所得誤差加到系統(tǒng)的輸入端，從而調(diào)節(jié)系統(tǒng)的輸出值[12]?？刂圃硪?jiàn)圖5，系統(tǒng)的輸入值是根據(jù)系統(tǒng)的輸出值實(shí)時(shí)變化，最終構(gòu)成閉環(huán)系統(tǒng)，從而精確地調(diào)節(jié)系統(tǒng)的輸出值。PID控制器中的誤差是由給定值r(t)和實(shí)際的輸出值y(t)所組成的。給定值與輸出值之間偏差e(t)為：

e(t)=r(t)-y(t)

(3)

圖4 比例電磁閥工作曲線Fig.4 Working curve of proportional solenoid valve

PID的控制公式為：

(4)

式中kp為比例系數(shù)，Ti為常數(shù)，Td為微分時(shí)間常數(shù)。其中，比例環(huán)節(jié)能夠成比例地反映偏差信號(hào)e(t)，通過(guò)控制kp可以提高系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)精度；積分環(huán)節(jié)可以用來(lái)消除靜態(tài)誤差以提高整個(gè)系統(tǒng)的精度；微分環(huán)節(jié)用來(lái)反映e(t)的變化趨勢(shì)，以有效加快系統(tǒng)調(diào)節(jié)速度從而縮短調(diào)節(jié)時(shí)間[13]。

圖5 系統(tǒng)PID控制原理圖Fig.5 System PID control schematic

由微流控芯片的流道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞尺寸相關(guān)性可知，當(dāng)樣品溶液在微流孔芯片中流動(dòng)時(shí)，其黏滯力和表面張力的作用變得十分顯著，微流控芯片中的流阻不斷增大，為確保進(jìn)樣速度的穩(wěn)定，需不斷調(diào)整氣體驅(qū)動(dòng)壓力的大小。該進(jìn)樣系統(tǒng)采用流量傳感器(法國(guó)ELveflow公司，型號(hào)FS4)實(shí)時(shí)檢測(cè)微流控芯片進(jìn)樣過(guò)程的流量，并作為反饋信號(hào)反饋至PID控制器，從而構(gòu)成閉環(huán)的流量調(diào)節(jié)系統(tǒng)。當(dāng)設(shè)定的液體流量與實(shí)際反饋端的流量不吻合時(shí)，PID控制器調(diào)節(jié)比例電磁閥的輸出，直至所設(shè)定的氣體壓力值和實(shí)際的氣壓值相等，從而提高了密閉容器內(nèi)的氣壓的控制精度，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)的高精度進(jìn)樣及穩(wěn)定性。

3 硬件電路設(shè)計(jì)

系統(tǒng)的硬件電路主要包括微控制器模塊、氣體壓力及液體流量采集模塊、氣體壓力控制模塊、串口通信模塊、電源模塊等。整體硬件電路框圖見(jiàn)圖6。

進(jìn)樣系統(tǒng)硬件模塊主要以微控制器STM32F103ZET6為核心，氣體壓力傳感器、液體流量傳感器分別將密閉容器的氣壓信號(hào)、微流控芯片入口處的液體流量信號(hào)送至信號(hào)采集模塊，信號(hào)采集模塊中的模數(shù)轉(zhuǎn)換(Analog-to-Digital Convert)電路將信號(hào)處理后供以微控制器處理；氣體壓力控制模塊主要由PID控制器、比例電磁閥、DAC8653數(shù)模轉(zhuǎn)換電路、OP2172等比例放大電路組成，用于輸出分辨率為0.001 V、0～10 V的可調(diào)電壓信號(hào)，控制比例電磁閥，進(jìn)而控制密閉溶液瓶中氣壓的調(diào)節(jié)；氣源壓力輸出模塊主要由氣泵及其驅(qū)動(dòng)電路組成，微控制器根據(jù)串口通信模塊控制氣源壓力的啟動(dòng)和停止、控制密閉容器的壓力大小、傳輸氣壓與液體流量數(shù)據(jù)；串口通信模塊主要完成與上位機(jī)的通信，以使整個(gè)系統(tǒng)協(xié)調(diào)運(yùn)行。

圖6 氣體壓力控制硬件電路框圖Fig.6 Gas pressure control hardware circuit block diagram

4 進(jìn)樣控制系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)

上位機(jī)軟件采用Visual Studio2015軟件開(kāi)發(fā)平臺(tái)，用C++編程，該進(jìn)樣系統(tǒng)上位機(jī)軟件主要的功能包括進(jìn)樣通道的選擇、流量及進(jìn)樣時(shí)間的設(shè)定、氣壓和液體流量信號(hào)的采集及顯示等，其軟件流程圖見(jiàn)圖7。

進(jìn)樣前，首先設(shè)置好通道、進(jìn)樣量、進(jìn)樣時(shí)間、進(jìn)樣速度等參數(shù)并保存。進(jìn)樣開(kāi)始后，在界面上顯示當(dāng)前氣壓和液體流量值，并實(shí)現(xiàn)了通過(guò)波形持續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流量的變化。進(jìn)樣結(jié)束后該系統(tǒng)軟件可以自動(dòng)關(guān)閉當(dāng)前檢測(cè)通道的氣壓輸出，實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣過(guò)程的自動(dòng)化。通過(guò)串口通信讀取下位機(jī)的壓力和流量數(shù)據(jù)，由上位機(jī)實(shí)現(xiàn)對(duì)進(jìn)樣流量等指標(biāo)的設(shè)定并進(jìn)行顯示。

圖7 進(jìn)樣系統(tǒng)軟件總體流程圖Fig.7 Overall flow chart of the injection system software

5 系統(tǒng)可靠性測(cè)試

將2 mL含有10 000個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的模擬血溶液稀釋20倍，每次取稀釋后的模擬血溶液2 mL以20、30、40 mL/h的速度進(jìn)樣，每種流速下進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，時(shí)間間隔為2 d，驗(yàn)證進(jìn)樣過(guò)程中的壓力驅(qū)動(dòng)的可靠性。實(shí)驗(yàn)環(huán)境在暗室內(nèi)，基本視為無(wú)環(huán)境影響因素，讀取并記錄每種進(jìn)樣速度下的流量數(shù)據(jù)，計(jì)算測(cè)量數(shù)據(jù)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表1。

表1 壓力進(jìn)樣系統(tǒng)可靠性測(cè)試結(jié)果Table 1 Pressure injection system reliability test results

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19進(jìn)行可靠性分析，每種流速下兩次進(jìn)樣的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.85，說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的壓力進(jìn)樣系統(tǒng)具有良好的可靠性。

6 討論

本研究基于氣壓驅(qū)動(dòng)的原理設(shè)計(jì)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選進(jìn)樣系統(tǒng)具有較高的流量調(diào)節(jié)精度及較大的流量調(diào)節(jié)范圍，同時(shí)能夠有效地避免微量注射泵進(jìn)樣系統(tǒng)和微量蠕動(dòng)泵進(jìn)樣系統(tǒng)中的流量脈動(dòng)問(wèn)題以及進(jìn)樣不完全等問(wèn)題。系統(tǒng)采用的stm32單片機(jī)外設(shè)資源豐富、功耗低，結(jié)合微型比例電磁閥以及PID控制器的介入，確保了整個(gè)進(jìn)樣過(guò)程中具有穩(wěn)定的流量輸出。系統(tǒng)還可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)進(jìn)樣過(guò)程中的氣壓和液體流量信號(hào)，為提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選效果提供技術(shù)保障。本系統(tǒng)采用的是傳統(tǒng)的PID控制算法，針對(duì)特定的微流控芯片使用了預(yù)設(shè)的PID控制參數(shù)，但當(dāng)微流控芯片結(jié)構(gòu)以及所需的流速發(fā)生改變時(shí)，系統(tǒng)的閉環(huán)調(diào)節(jié)性能會(huì)有所降低，為進(jìn)一步增強(qiáng)系統(tǒng)的魯棒性，可通過(guò)模糊控制理論設(shè)計(jì)模糊PID控制器實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的閉環(huán)調(diào)節(jié)，該項(xiàng)控制的優(yōu)化尚待進(jìn)一步研究。