李亞芹，鄧林紅，歐陽明星

(常州大學生物醫(yī)學工程與健康科學研究院，常州 213164)

1 引 言

T淋巴細胞(T lymphocyte)簡稱T細胞，在胸腺發(fā)育完成后，通過淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能[1]。T細胞免疫是機體防御腫瘤細胞和病原生物的屏障，其功能正常對人類抵御疾病至關重要[2]。T細胞功能低下的人通常需要服用免疫調節(jié)藥物以維持人體健康。

異丙肌苷是一種免疫調節(jié)藥物，體外實驗證明，它能促進處于有絲分裂中的T細胞的分化和增殖[3]。但目前異丙肌苷促進T細胞增殖的相關信號分子調控機制尚不太清楚。本研究希望通過探究與T細胞活化增殖相關的分子如細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、鈣離子(Ca2+)信號通路、非受體酪氨酸激酶Src/小G蛋白家族成員Ras的變化情況，以達到初步了解異丙肌苷促進T細胞增殖的信號機制的目的。

ERK信號傳遞途徑是涉及調節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂的信號網(wǎng)絡的核心，是細胞增殖的關鍵分子[4]。目前已有研究表明，ERK活性可影響T細胞的活化增殖[5]。基于此，本研究擬通過探討異丙肌苷是否上調ERK活性從而促進T細胞增殖。為了驗證該猜想，使用了一種基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技術原理的探針[6-7]，將ERK激酶FRET探針轉染進入T細胞，檢測異丙肌苷對T細胞中ERK激酶活性的影響。

Src和Ras均為ERK上游信號分子，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)二者的活性對T細胞的發(fā)育和功能至關重要[8-9]。因此,Src-Ras-ERK這條信號通路很有可能介導了異丙肌苷對T細胞的促增殖作用。此外，F(xiàn)azal等[10]發(fā)現(xiàn)ERK活性受胞內Ca2+濃度的調控，并且已有研究證明胞內Ca2+濃度會影響T細胞的激活[11]，所以本研究還探討了Ca2+信號通路是否參與異丙肌苷的免疫調節(jié)作用。

2 材料與方法

2.1 材料、試劑與儀器

人T淋巴白血病細胞(Jurkat, Clone E6-1)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司；洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park memorial institute, RPMI)-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，美國Gibco公司；Src抑制劑PP1、Ras抑制劑Salirasib，美國Sigma公司；異丙肌苷、ERK抑制劑PD98059和Ca2+抑制劑U71322，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK8溶液，上海碧云天生物技術有限公司；激光共聚焦培養(yǎng)皿，20 mm，無錫耐思生物科技有限公司；用于懸浮細胞的T重懸緩沖液和E電緩沖液電轉試劑，美國Thermo公司。

FRET顯微鏡平臺，Cell Observer, Zeiss Inc., 德國；倒置顯微鏡，Primo Vert, Zeiss Inc., 德國；電轉儀，Neon 0.5～ 2.5 Kv, Thermo Inc., 美國。

2.2 方法

2.2.1細胞培養(yǎng) Jurkat細胞所用培養(yǎng)基為含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)在37 ℃恒溫、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

2.2.2通過CCK8法篩選出異丙肌苷促進T細胞增殖的最佳濃度 以每孔5 000個細胞的密度將Jurkat細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分別加入終濃度為0、5、10、20、40、80、160、320、640 μg/mL的異丙肌苷，每個濃度有10個重復組合。培養(yǎng)48 h后，向每孔加10 μL CCK8溶液。然后將培養(yǎng)板放至37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定OD 450 nm值，進而篩選出異丙肌苷促進T細胞增殖的最佳濃度。

2.2.3Jurkat細胞轉染FRET探針 Jurkat細胞電轉FRET探針的操作步驟如下：在24孔細胞培養(yǎng)板的每個孔中加入500 μL細胞培養(yǎng)基，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中預熱；按每孔接種2×105個細胞來計算所需細胞量，將細胞懸液離心，用適量磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次；加入T重懸緩沖液重懸細胞，加入1 μg微量質粒于重懸液中，用移液槍吸10 μL混懸液；將移液槍插入電轉儀中，設電壓為1 325 V，時間為10 ms，電擊脈沖數(shù)為3次；電轉結束后，將移液槍中的液體加入至此前預熱的培養(yǎng)基中，放于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2.4FRET顯微鏡采集Jurkat細胞的FRET圖像 FRET顯微鏡系統(tǒng)配置有多點定位功能、自動調焦功能以及維持溫度和5% CO2條件的細胞培養(yǎng)盒。FRET顯微鏡上，ECFP成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(480±20)nm；FRET成像通道的熒光濾片參數(shù)為激發(fā)(436±10) nm，分光455 nm，發(fā)射(535±15) nm。FRET成像時，通過成像軟件自動快速切換ECFP和FRET成像通道，以實現(xiàn)該雙通道圖像的實時采集。實驗中，吸取100 μL細胞懸液置于共聚焦皿中間的玻璃孔上，放置于顯微鏡的細胞培養(yǎng)盒中，這里選擇較少量的培養(yǎng)液有助于減少T細胞的浮動。接下來約10 min內，通過成像軟件選定多個熒光細胞觀察位置，然后使用40或100倍油鏡，在顯微鏡下進行多位點的FRET圖像采集。

2.2.5FRET圖像數(shù)據(jù)的定量分析及統(tǒng)計分析 通過以MATLAB軟件平臺開發(fā)的FRET圖像分析軟件Fluocell 6.0.0(Lu S et al., 美國)進行數(shù)據(jù)分析[12]，該軟件包的下載地址為：http://github.com/lu6007/fluocell。實驗分析數(shù)據(jù)以“平均值+標準差”表示，用統(tǒng)計分析軟件Origin 8.0(Originlab Inc., 美國)和GraphPad Prism 6.0(GraphPadSoftware Inc., 美國)進行分析，采用t檢驗比較各組數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 異丙肌苷激活Jurkat細胞的ERK活性

為了確定異丙肌苷促進Jurkat細胞增殖的最佳藥物濃度，細胞培養(yǎng)中加入不同濃度梯度的異丙肌苷，共培養(yǎng)48 h后，通過CCK8法檢測細胞增殖差異。實驗結果見圖1，異丙肌苷濃度為80 μg/mL時促細胞增殖效果最明顯，因此，后續(xù)實驗中選擇異丙肌苷的作用濃度為80 μg/mL。

接下來分析異丙肌苷是否影響到細胞內的ERK激酶活性。轉染ERK FRET的Jurkat細胞在添加80 μg/mL異丙肌苷條件下培養(yǎng)48 h后在FRET顯微鏡下進行熒光成像。通過FRET定量和統(tǒng)計分析，結果見圖2，表明異丙肌苷能明顯激活Jurkat細胞中ERK活性。為了進一步驗證ERK激酶是否調控異丙肌苷對Jurkat細胞的促增殖作用，以添加80 μg/mL異丙肌苷的Jurkat細胞為對照組，在此基礎上用10 μmol/L的ERK抑制劑PD98059處理的細胞為實驗組，培養(yǎng)48 h后，通過CCK8法檢測細胞增殖差異。結果見圖3，ERK抑制劑明顯抑制了異丙肌苷促Jurkat細胞增殖效果。這些結果顯示異丙肌苷通過激活ERK促進Jurkat細胞增殖。

圖1 采用CCK8法檢測異丙肌苷對Jurkat細胞的增殖影響(* P<0.05)Fig.1 The effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells detected by CCK8 assay(* P<0.05)

圖2 異丙肌苷對Jurkat細胞中ERK活性的影響(* P<0.05)Fig.2 Effect of Isoprinosine on ERK activity in Jurkat cells(* P<0.05)

圖3 PD98059抑制了異丙肌苷對Jurkat細胞增殖的促進作用(* P<0.05)Fig.3 PD98059 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

3.2 Src激酶參與調節(jié)異丙肌苷激活ERK活性

Src激酶是調控ERK活性的重要上游信號之一，因此，本研究檢測Src是否參與調節(jié)異丙肌苷激活ERK，從而促進Jurkat細胞的增殖。通過加入10 μmol/L Src激酶抑制劑PP1并進行CCK8實驗，發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了異丙肌苷的促增殖作用，結果見圖4，證明了異丙肌苷促進Jurkat細胞增殖與Src/ERK信號通路相關。為了進一步證明這一點，將轉染ERK FRET的Jurkat細胞用異丙肌苷處理48 h，再用PP1(10 μmol/L)處理3 h，進行FRET成像，并和未經(jīng)PP1處理的對照組比較。結果見圖5， PP1能顯著抑制異丙肌苷誘導的ERK活性。因此Src激酶信號參與調控異丙肌苷誘導的ERK活性，促進Jurkat細胞增殖。

圖4 PP1抑制了異丙肌苷對Jurkat細胞增殖的促進作用(* P<0.05)Fig.4 PP1 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

圖5 PP1對異丙肌苷處理48 h的Jurkat細胞中ERK活性影響(* P<0.05)Fig.5 Effect of PP1 on ERK activity in Jurkat cells treated with Isoprinosine for 48 h(* P<0.05)

3.3 Ras激酶參與調節(jié)異丙肌苷激活ERK活性

Ras激酶處于Src激酶的下游，也是調控ERK活性的上游激酶之一。加入75 μmol/L Ras激酶抑制劑Salirasib，通過CCK8法發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了80 μg/mL異丙肌苷對Jurkat細胞增殖的促進作用，結果見圖6，表明異丙肌苷促進Jurkat細胞增殖與Ras/ERK信號通路相關。將轉染ERK FRET的Jurkat細胞用異丙肌苷處理48 h，然后用Salirasib(75 μmol/L)處理3 h，進行FRET成像。結果見圖7，經(jīng)Salirasib處理后，Jurkat細胞群體水平上的ERK活性明顯降低。由圖7可知，統(tǒng)計學上的差異性分析也證實Salirasib能顯著抑制異丙肌苷誘導的ERK活性。因此異丙肌苷通過Ras/ERK信號通路去促進Jurkat細胞的增殖。

圖6 Salirasib抑制了異丙肌苷對Jurkat細胞增殖的促進作用(* P<0.05)Fig.6 Salirasib inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

3.4 異丙肌苷通過促進Ca2+內流影響Jurkat細胞增殖

Ca2+也是調控Ras/絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK/Erk kinase, MEK)/ERK通路的重要上游信號之一[13]，因此，本研究檢測了異丙肌苷對Jurkat細胞中Ca2+信號的影響。通過將Miyawaki等[14]研發(fā)和改進的Ca2+FRET探針轉染進入Jurkat細胞，可以實時監(jiān)測胞內Ca2+濃度變化[6]。轉染Ca2+探針的Jurkat細胞加入異丙肌苷處理48 h，然后將異丙肌苷處理或對照未處理的細胞置于共聚焦皿上，進行FRET成像并比較，實驗結果見圖8，異丙肌苷刺激了Jurkat細胞內Ca2+濃度升高。為進一步驗證異丙肌苷是否可通過鈣信號通路影響Jurkat細胞的增殖，用Ca2+抑制劑U71322(20 μmol/L)處理與異丙肌苷共培養(yǎng)的Jurkat細胞48 h后用CCK8法分析檢測，結果見圖9，U71322明顯抑制異丙肌苷促增殖的影響。

圖7 Salirasib對異丙肌苷處理48 h的Jurkat細胞中ERK活性影響(* P<0.05)Fig.7 Effect of Salirasib on ERK activity in Jurkat cells treated with Isoprinosine for 48 h(* P<0.05)

圖8 異丙肌苷刺激Jurkat胞漿Ca2+濃度上升(* P<0.05)

圖9 U73122抑制了異丙肌苷對Jurkat細胞增殖的促進作用(* P<0.05)Fig.9 U73122 inhibited the effect of Isoprinosine on the proliferation of Jurkat cells(* P<0.05)

4 討論

體內T細胞正?；罨菍崿F(xiàn)機體免疫功能的基本要求，具體表現(xiàn)為T細胞增殖、分化、分泌免疫因子等。已有研究表明，異丙肌苷作為免疫治療藥物能夠促進T細胞的分化與增殖。本研究探索了異丙肌苷活化Jurkat細胞的相關信號機制。研究發(fā)現(xiàn)異丙肌苷能顯著激活Jurkat細胞中的ERK活性，并對其上游機制做了進一步的研究。

Src和Ras是MEK-ERK通路的重要上游信號，影響著細胞的生長分裂[16]。我們研究了異丙肌苷激活T細胞過程中Src/Ras的作用，通過使用Src/Ras抑制劑PP1/salirasib間接地證明了異丙肌苷需要通過Src/Ras信號上調ERK活性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)異丙肌苷還可刺激Jurkat細胞Ca2+信號，幫助進一步激活ERK活性從而影響細胞增殖。

綜上所述，我們研究了異丙肌苷促進Jurkat細胞增殖的具體作用機制。異丙肌苷通過T細胞的胞內Src/Ras和鈣信號上調其ERK活性，進而影響Jurkat細胞的增殖。由于實驗條件的限制，本研究使用的Jurkat細胞屬于淋巴系白血病T細胞，所得到的研究結論值得進一步用原代T細胞驗證。盡管如此，此研究仍為異丙肌苷治療免疫性疾病及腫瘤的作用機制及應用前景提供了一些依據(jù)，也為一些免疫治療新藥的研發(fā)帶來了一些啟發(fā)。