王迦琦,許夢然,高婧文,葛俊宏,孫 新,*

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院,吉林吉林 132013; 2.吉林省分子老年重點實驗室,北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013)

北蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草、蛹蟲草,屬于子囊菌門,麥角菌科,蟲草屬,是我國傳統(tǒng)藥用真菌之一,在醫(yī)藥和功能性食品方面均有較高的實用價值[1]。北蟲草最初因具備顯著增強機體免疫的作用而被人們所熟知,其所含的活性成分已然成為真菌學(xué)研究的熱點[2]。北蟲草多糖(Cordycepsmilitarispolysaccharides,CMP)作為北冬蟲夏草主要活性成分之一,主要是由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖等單糖組成[3-4],并具備抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂等多種藥理活性,其中以抗氧化作用尤為顯著[5-8]。

活性氧自由基(ROS)是細胞在正常呼吸和新陳代謝中源源不斷產(chǎn)生的一類內(nèi)源性自由基,是一類非?；钴S的電子基團,主要包括H2O2、羥基自由基和超氧陰離子等[9]。ROS在較低濃度時對免疫應(yīng)答和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等細胞功能調(diào)節(jié)非常重要,然而當機體受到外界有害因素刺激時,細胞內(nèi)ROS水平升高,導(dǎo)致抗氧化物的清除能力下降,進而加速氧化DNA、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)等生物大分子,從而引發(fā)一系列疾病的產(chǎn)生[10-14]。近年來,由氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的冠狀動脈粥樣硬化、缺血性腦損傷,肺栓塞等血管疾病的發(fā)病率逐年增加[15-16]。血管平滑肌細胞在調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)、維持血管張力中起到重要作用[17-18],當其生理功能發(fā)生改變時會引起冠狀動脈鈣化、高血壓以及支架內(nèi)再狹窄等多種細胞病理學(xué)病變[19-20],因此從植物中提取天然的“ROS清除劑”,保護血管平滑肌細胞過氧化,對由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心血管疾病的發(fā)生起到防治作用。過氧化氫(Hydrogen peroxide H2O2)在細胞內(nèi)會分解成極具破壞性的羥基自由基,使細胞內(nèi)活性氧水平升高,進而加速細胞氧化損傷進程[21-22]。

現(xiàn)有文獻中,對北蟲草多糖的提取大多為超聲提取法,此法易引起多糖活性成分降低[23],因此本文在水提醇沉法基礎(chǔ)上采用四因素三水平正交實驗優(yōu)化北蟲草多糖的提取工藝,并通過 H2O2構(gòu)建大鼠主動脈平滑肌細胞(Rat aortic smooth muscle cells,A10)氧化損傷模型,探討北蟲草多糖的體外抗氧化活性,為北蟲草多糖進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 材料與儀器

北蟲草 長白山特色植物種植基地;A10細胞 北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司;FRAP總抗氧能力檢測試劑盒、ROS細胞染色試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司;胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)液 美國Gibco公司;MTT 美國Amresco公司;化學(xué)試劑 均為分析純。

Infinite M200 PRO酶標儀 美國Beckman公司;TH4-200倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;TDL-5-R低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;EZ585型凍干機 美國SIM公司;MCO-18AICUVL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Panasonic公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 北蟲草多糖的提取工藝 將干燥的北蟲草粉粹后過40目篩,稱重后乙醇脫脂回流處理。選擇一定的提取溫度,提取次數(shù)、提取時間以及料液比,通過水提醇沉法提取北蟲草多糖。將水提液濃縮至一定體積后,3000 r/min離心處理濾去多糖殘渣,在緩慢滴加4倍體積的無水乙醇至乙醇終濃度為80%,4 ℃靜置過夜,4000 r/min離心,棄上清取沉淀依次用無水乙醇、乙醚梯度洗脫后即為北蟲草粗多糖。將此粗多糖用蒸餾水配制成5%多糖溶液,放于-80 ℃過夜處理,4000 r/min離心棄沉淀取上清,反復(fù)凍融直至無沉淀析出,此法初步去除糖溶液中的蛋白質(zhì)成分。將此糖溶液按體積比4∶1加入sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)進行混合,劇烈振蕩1 h,4000 r/min離心后取上清,中間層為蛋白質(zhì),下層為有機試劑層,重復(fù)此法直至離心后糖溶液中無變性蛋白質(zhì)析出為止。并通過3500 Da透析去除糖溶液中無機鹽、葡萄糖等小分子雜質(zhì),冷凍干燥處理后即為北蟲草多糖。根據(jù)下式計算北蟲草多糖得率。

式中,m多糖為上述提取出的北蟲草多糖的質(zhì)量,g;m北蟲草為最初北蟲草原材料的質(zhì)量,g。

1.2.2 單因素提取實驗 按照1.2.1所述多糖提取工藝,對提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比4個因素對北蟲草多糖得率的影響進行研究。

1.2.2.1 提取溫度對北蟲草多糖得率的影響 在料液比1∶30 g/mL、提取時間3 h、提取次數(shù)3次的條件下,分別設(shè)定提取溫度60、70、80、90、100 ℃,檢測不同提取溫度對北蟲草多糖得率的影響。

1.2.2.2 提取時間對北蟲草多糖得率的影響 在料液比1∶30 g/mL、提取次數(shù)3次、提取溫度80 ℃的條件下,分別設(shè)定提取時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h,檢測不同提取時間對北蟲草多糖得率的影響。

1.2.2.3 提取次數(shù)對北蟲草多糖得率的影響 在料液比1∶30 g/mL、提取時間3 h、提取溫度80 ℃的條件下,分別設(shè)定提取次數(shù)1、2、3、4、5次,檢測不同提取時間對北蟲草多糖得率的影響。

1.2.2.4 料液比對北蟲草多糖得率的影響 在提取溫度80 ℃、提取時間為3 h,提取次數(shù)3次條件下,分別設(shè)定料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL,檢測不同料液比對北蟲草多糖得率的影響。

1.2.3 L9(34)正交實驗優(yōu)化北蟲草多糖提取工藝 考慮水提醇沉過程中料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)各因素的交合作用,對北蟲草多糖的工藝參數(shù)進一步優(yōu)化,以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ),進行四因素三水平L9(34)正交實驗,實驗因素設(shè)置見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Level and coding of experimental factor

1.2.4 羥自由基清除率測定 取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL不同濃度的北蟲草多糖(CMP)以及相同濃度下的陽性對照維生素E(VE)對羥基自由基清除率進行測定。步驟如下:實驗組于96孔板中依次加入預(yù)先配制6 mmol/L的FeSO4、上述濃度下的CMP或VE、6 mmol/L水楊酸以及6 mmol/L 30% H2O2各100 μL;實驗對照組依次加入6 mmol/L的FeSO4、蒸餾水、6 mmol/L水楊酸以及6 mmol/L 30% H2O2各100 μL;空白對照組依次加入6 mmol/L的FeSO4、蒸餾水、不同濃度下的CMP或VE以及6 mmol/L 30% H2O2各100 μL。搖床混勻,室溫靜置30 min后,510 nm處測其吸光度值,根據(jù)下式計算CMP和VE的清除率:

式中:A0為水代替CMP或VE測得的吸光度,A1為不同濃度的CMP或VE測得的吸光度,A2為水代替水楊酸時不同CMP或VE所測得的吸光度值。

1.2.5 DPPH自由基清除率測定 取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL不同濃度CMP以及相同濃度下的陽性對照VE對DPPH自由基清除率進行測定。步驟如下:實驗組取上述不同濃度的CMP或VE200 μL加入96孔板中,再加入無水乙醇配制2×10-4mol·L-1的DPPH溶液200 μL;實驗對照組每孔加入200 μL蒸餾水和不同濃度CMP或VE;空白對照組每孔加入200 μL蒸餾水和200 μL DPPH溶液。搖床混勻10 min后,室溫避光處理30 min,517 nm處測其吸光度,根據(jù)下式計算CMP和VE的清除率:

式中:A1為不同濃度的CMP或VE加DPPH測得的吸光度,A2為不同濃度的CMP或VE加水測得的吸光度,A0為只加水和DPPH所測得的吸光度值。

1.2.6 FRAP法測定總抗氧化能力 取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL不同濃度CMP以及相同濃度下的陽性對照VE對亞鐵離子的還原能力進行檢測,測定CMP總抗氧化能力。步驟如下:將100 mmol/L FeSO4·7H2O依次稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L作為標準曲線。實驗組于96孔板中每孔加入180 μL FRAP工作液和10 μL上述不同濃度的CMP或VE;實驗對照空每孔加180 μL蒸餾水和10 μL CMP或VE;空白對照孔加180 μL FRAP工作液和10 μL蒸餾水;標準曲線孔內(nèi)加入10 μL 0.15～1.5 mmol/L不同濃度的FeSO4標準溶液。37 ℃避光孵育5 min,于593 nm處測其吸光度值。根據(jù)FeSO4標準曲線測定CMP和VE對FRAP鐵離子還原能力。

1.2.7 MTT細胞活力測定

1.2.7.1 檢測CMP對A10細胞增殖作用的影響 用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)A10細胞后,將處于對數(shù)生長期的A10細胞接種于96孔板中(3500 cells/孔),依次設(shè)置control組(對照組),25、50、100、200、400 μg/mL CMP組(實驗組)和空白組,每組5個平行復(fù)孔,并將其置于含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。CMP組分別用上述多糖濃度處理24 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),置于培養(yǎng)箱孵育4 h后,小心吸取上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床混勻后,于490 nm處測定吸光度值。根據(jù)下式對細胞存活率進行計算,確定北蟲草多糖實驗劑量。

式中,A實驗組為CMP處理組測得的吸光度值,A對照組為不加CMP所測得的吸光度,A空白組為不加細胞只含DMEM培養(yǎng)基的吸光度。

1.2.7.2 檢測 H2O2對A10細胞增殖作用的影響 用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)A10細胞后,將處于對數(shù)生長期的A10細胞接種于96孔板中(3500 cells/孔),依次設(shè)置control組(對照組),100、200、300、400 μmol/L H2O2組(實驗組)和空白組,每組5個平行復(fù)孔,并將其置于含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。H2O2組分別用上述濃度處理24 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),置于培養(yǎng)箱孵育4 h后,小心吸取上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床混勻后,于490 nm處測定吸光度值。根據(jù)下式對細胞存活率進行計算,確定H2O2實驗劑量。

式中,A實驗組為H2O2模型組測得的吸光度值,A對照組為不加H2O2所測得的吸光度,A空白組為不加細胞只含DMEM培養(yǎng)基的吸光度。

1.2.7.3 檢測 CMP對H2O2處理A10細胞增殖作用的影響 用含有10% FBS的DMDM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)A10細胞后,將處于對數(shù)生長期的A10細胞接種于96孔板中(3500 cells/孔),依次設(shè)置control組(對照組)、H2O2模型組(實驗組),CMP給藥組(實驗組)和空白組,每組5個平行復(fù)孔,并將其置于含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。首先用25、50、100、200 μg/mL CMP預(yù)處理A10細胞24 h后,給藥組和模型組同時加入4 μL 10 mol/L H2O2(至終濃度為200 μmol/L)處理細胞24 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),置于培養(yǎng)箱孵育4 h后,小心吸取上清,每孔加入150 μL DMSO,搖床混勻后,于490 nm處測定吸光度值,并根據(jù)下式對細胞存活率進行計算。

式中,A實驗組為CMP給藥組或H2O2模型組測得的吸光度值,A對照組為不加CMP或H2O2所測得的吸光度,A空白組為不加細胞只含DMEM培養(yǎng)基的吸光度。

1.2.8 細胞內(nèi)活性氧(ROS)染色分析 為了檢測CMP是否對H2O2誘導(dǎo)的A10細胞氧化損傷具有保護作用,采用ROS細胞染色法,以DCFH-DA為裝載探針,進入細胞后先被酯酶水解成無熒光的DCFH,后進一步被ROS氧化成帶綠色熒光的DCF,以此分析細胞內(nèi)ROS水平,間接反應(yīng)細胞氧化程度。用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)A10細胞后,將處于對數(shù)生長期的A10細胞接種于6孔板中(50000 cells/孔),依次設(shè)置control組、H2O2模型組和CMP給藥組,將其置于含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜。首先用100、200 μg/mL CMP預(yù)處理細胞24 h,接著用200 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h,使用Beytime ROS染色試劑盒評估細胞內(nèi)活性氧水平,倒置熒光顯微鏡對染色細胞進行拍攝。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均為三次平行實驗,數(shù)據(jù)表示為Mean±SD。GraphPad Prism 6軟件用于統(tǒng)計計算,ANOVA單因素方差分析用于實驗組內(nèi)比較,P<0.05差異表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 CMP得率隨溫度的變化 不同的溫度對多糖得率有明顯影響。如圖1,隨溫度升高,多糖得率表現(xiàn)為先上升后下降趨勢,在提取溫度為90 ℃時,多糖得率達到峰值為7.88%。在一定范圍內(nèi),隨溫度升高多糖溶質(zhì)分子溶出速度加快,提取率升高[24]。因此提取溫度選取80、90和100 ℃進行正交實驗。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extract temperature on polysaccharides yield

2.1.2 CMP得率隨時間的變化 不同的提取時間對多糖得率有明顯影響。如圖2所示,提取時間從2.0 h增加到3.0 h時,多糖提取率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，由2.45%增加到最大提取率6.32%。隨提取時間進一步延長,多糖提取率趨于平緩,因此提取時間選取3.0、3.5和4.0 h進行正交實驗。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharides yield

2.1.3 CMP得率隨次數(shù)的變化 不同的提取次數(shù)對多糖得率有明顯影響。如圖3,提取次數(shù)由1次增加到3次時,多糖提取率呈現(xiàn)線性上升趨勢,多糖得率從2.23%增加到達到最大值6.58%。之后隨次數(shù)的增加,多糖得率略有下降,這是因為超過一定提取次數(shù)后,多糖無法進一步溶解,因此提取次數(shù)選取2、3和4次進行正交實驗。

圖3 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on polysaccharides yield

2.1.4 CMP得率隨料液比的變化 不同的料液比對多糖得率有明顯影響。如圖4,在料液比1∶20～1∶30 g/mL范圍內(nèi),多糖得率由4.92%增加到6.89%,呈現(xiàn)明顯上升趨勢,隨著料液比進一步增加,多糖得率逐漸呈現(xiàn)下降趨勢,可能原因是液體比例的增加影響提取體系的傳熱功能,不利于多糖成分溶解[25],因此提取時選取1∶25、1∶30和1∶35 g/mL料液比進行正交實驗。

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ratio of raw materia to water on polysaccharides yield

2.2 L9(34)正交實驗法優(yōu)化CMP提取工藝

CMP正交實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示,影響CMP得率的主次因素依次是A>D>C>B,即提取溫度影響最大,其次是料液比、提取次數(shù)和提取時間。多糖得率最優(yōu)組合為A2B1C2D2,即北蟲草多糖得率最佳提取工藝為提取溫度90 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取次數(shù)3次、提取時間3.0 h,在此條件下獲得最高多糖得率為7.94%±0.16%。

表2 北蟲草多糖正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results of Cordyceps militaris polysaccharide

2.3 CMP抗氧化活性檢測

2.3.1 CMP清除羥自由基的能力 如圖5所示,CMP和VE在0.05～1.6 mg/mL濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除能力隨劑量依賴性增加。在較低濃度0.05 mg/mL時,CMP對羥自由基的清除率為60.61%±1.09%,且呈逐漸上升趨勢,相同濃度下VE對羥自由基的清除率僅為37.77%±2.18%;在濃度為1.6 mg/mL時,VE對羥自由基的清除能力上升到60.56%±2.24%,仍顯著低于相同濃度下CMP對羥基自由基的清除率75.57%±1.39%(P<0.05)。CMP及VE清除羥自由基的IC50值分別為0.019和0.21 mg/mL,實驗結(jié)果表明CMP較VE更具顯著清除羥基自由基的能力(P<0.05)。

圖5 北蟲草多糖對羥基自由基清除率的影響Fig.5 Effect of polysaccharides from Cordyceps militaris on the clearance rate of hydroxyl radicals注:與VE組比較,*表示差異顯著(P<0.05),圖6～圖7同。

2.3.2 CMP清除DPPH自由基的能力 如圖6所示,在0.05～1.6 mg/mL范圍內(nèi),CMP和VE對DPPH自由基的清除能力隨劑量依賴性增加。在濃度為0.05 mg/mL時,CMP對DPPH自由基的清除率為22.79%±0.59%,VE對DPPH自由基的清除率為20.26%±0.41%,在此濃度時CMP體現(xiàn)出VE相似的自由基清除活性,但隨劑量不斷增加,在濃度為1.6 mg/mL時CMP對DPPH自由基率為80.23%±2.75%,顯著高于相同濃度下VE對DPPH自由基的清除率51.32%±2.48%(P<0.05)。CMP及VE清除DPPH自由基的IC50值分別為0.24和1.13 mg/mL,結(jié)果表明CMP較VE更具顯著清除DPPH自由基的能力(P<0.05)。

圖6 北蟲草多糖對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on DPPH free radical scavenging rate

2.3.3 CMP總抗氧化能力測定 如圖7所示,在實驗濃度范圍內(nèi),CMP和VE對FRAP鐵離子的還原能力與劑量成正相關(guān)。在1.6 mg/mL時,CMP和VE對FRAP鐵離子的還原能力分別為(0.22±0.01)和(0.16±0.03) mmol/mg,表明CMP總抗氧化能力顯著強于相同濃度下的VE(P<0.05)。

圖7 北蟲草多糖對FRAP鐵離子還原能力的影響Fig.7 Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on FRAP iron ion reduction capacity

2.4 CMP對A10細胞氧化損傷的保護作用

2.4.1 CMP對A10細胞增殖的影響 如圖8所示,與Control組比較,用25～400 μg/mL不同濃度的CMP處理A10細胞24 h后,均增強細胞活力,促進細胞增殖,且在200 μg/mL時,CMP對A10細胞促增殖作用最強(P<0.001)。

圖8 北蟲草多糖對A10細胞存活率的影響Fig.8 Effect of CMP on survival rate of A10 cells注:與Control組比較,***差異高度顯著(P<0.001);**差異極顯著(P<0.01); *差異顯著(P<0.05);圖9同。

2.4.2 H2O2對A10細胞損傷的作用 如圖9所示,加入100～400 μmol/L H2O2處理A10細胞后,H2O2劑量依賴性誘導(dǎo)A10細胞存活率下降,且在濃度為200 μmol/L時,細胞存活率至Control組的61%,這是體外最適的細胞損傷量。因此,本研究選用25～200 μg/mL作為CMP下步實驗劑量,200 μmol/L作為H2O2誘導(dǎo)細胞損傷劑量。

圖9 H2O2對A10細胞存活率的影響Fig.9 Effect of H2O2 on survival rate of A10 cells

2.4.3 CMP對H2O2誘導(dǎo)的A10損傷細胞的影響 如圖10所示,與Control組相比,H2O2組誘導(dǎo)A10細胞存活率下降;與H2O2組比較,在加入25～200 μg/mL不同濃度CMP多糖預(yù)處理后,均促進細胞增殖,增強細胞活力,且在濃度為100～200 μg/mL時,CMP對H2O2誘導(dǎo)的A10細胞損傷保護作用高度顯著(P<0.001),因此本研究選擇100～200 μg/mL作為CMP后續(xù)細胞染色劑量。

圖10 CMP對H2O2誘導(dǎo)A10細胞氧化損傷的影響Fig.10 Effect of CMP on A10 cell damage induced by H2O2注:與Control組比較，###差異高度顯著(P<0.001); 與H2O2組比較，***差異高度顯著(P<0.001),**差異極顯著(P<0.01),*差異顯著(P<0.05);圖11同。

2.4.4 CMP抑制H2O2誘導(dǎo)A10細胞內(nèi)ROS生成 機體氧化進程加快,與細胞內(nèi)ROS生成密切相關(guān)[26]。如圖11所示,A為Control組,細胞內(nèi)表現(xiàn)為較少的綠色熒光;B為H2O2模型組,細胞內(nèi)呈現(xiàn)亮綠色熒光,表達高度的ROS水平,與Control組比較具有高度顯著性差異(P<0.001,圖11E所示);C、D分別為100 μg/mL 和200 μg/mL CMP預(yù)處理組,與H2O2組比較,細胞內(nèi)綠色熒光顯著減少,表達低的ROS水平,且以200 μg/mL CMP對H2O2誘導(dǎo)的A10內(nèi)ROS產(chǎn)生的抑制作用最強。

圖11 CMP對H2O2誘導(dǎo)A10細胞中ROS含量的影響(n=3)Fig.11 Effect of CMP on ROS content in A10 cells induced by H2O2(n=3)注:A：Control組細胞內(nèi)活性氧水平;B:H2O2處理組細胞內(nèi)活性氧水平;C:100 μg/mL CMP預(yù)處理組細胞內(nèi)活性氧水平; D:200 μg/mL CMP預(yù)處理組細胞內(nèi)活性氧水平;E:三次視野范圍下的計算出的陽性染色細胞百分數(shù)。

3 結(jié)論與討論

本文通過單因素實驗和L9(34)正交實驗法優(yōu)化CMP提取工藝,分析得出料液比、提取溫度、提取時間和次數(shù)四個因素及其相互作用對CMP得率的影響,并獲得多糖最佳提取參數(shù)為:提取溫度90 ℃,料液比1∶30 g/mL,提取次數(shù)3次,提取時間3.0 h,在此條件下多糖最高得率為7.94%±0.16%。

本研究發(fā)現(xiàn)CMP具有明顯增強A10細胞活力,促進細胞增殖的作用,并成功構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)A10細胞損傷模型,進一步闡述CMP可以保護由H2O2所引起的細胞活力降低、存活率下降等細胞損傷表征,具有天然維持細胞正常功能及活性的作用。細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多,會加速心血管疾病的發(fā)生,因此本研究繼續(xù)通過ROS細胞染色實驗評估CMP對H2O2誘導(dǎo)A10細胞中ROS含量的影響,結(jié)果表明在用200 μmol/L H2O2處理細胞24 h后細胞內(nèi)ROS水平約為正常對照組的26.67倍,證實H2O2誘導(dǎo)A10細胞存活率降低是由于H2O2引起的氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的A10細胞損傷,活力下降,而在加入CMP預(yù)處理后ROS含量顯著降低。因此,CMP可以保護A10細胞免受H2O2所引起的氧化應(yīng)激,對于維持血管正常功能,減輕血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重大意義。

H2O2在細胞內(nèi)主要通過損傷DNA和改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)加速細胞氧化進程[27-29]。文獻表明p53基因具有修復(fù)DNA損傷、抑制血管生成作用[30-32]。因此,后續(xù)研究將接著從p53-p21信號通路入手,深入研究CMP對血管平滑肌細胞氧化損傷的保護作用機制,為天然中藥材北蟲草的開發(fā)和利用提供新的研究方向。