黃倫輝,鮑會(huì)靜,張嘉懿,李軍普,崔亞瓊,李柳栩,劉運(yùn)德,李會(huì)強(qiáng)

(1.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,天津 300203; 2.天津市南開(kāi)醫(yī)院醫(yī)學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室,天津 300100; 3.天津市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 300074)

全世界已有超過(guò)10億人患有過(guò)敏性疾病,預(yù)計(jì)于2050年患病人群將達(dá)到40億[1]。雞蛋過(guò)敏(HEA)是第二大類常見(jiàn)的食物過(guò)敏,嬰兒患病率的比例高達(dá)9%,而其他主要食物過(guò)敏比例,如花生和芝麻分別為3%、0.8%[2-3]。食物過(guò)敏直接影響患者及其家人的生活質(zhì)量,弱化了兒童對(duì)社會(huì)的融入感[4]。當(dāng)過(guò)敏發(fā)生時(shí),患者往往很快表現(xiàn)為輕度蕁麻疹、惡心、腹痛和/或嘔吐、更嚴(yán)重的呼吸窘迫、低血壓/或死亡[5]。雞蛋是許多食品和其他蛋制品中的主要成分,在人們?nèi)粘ｏ嬍持泻茈y避免雞蛋[6]。

雞蛋過(guò)敏原集中分布在蛋黃和蛋清上,蛋清過(guò)敏原、卵粘蛋白(OVM)(Gal d 1、約11%)、卵清蛋白(OVA)(Gal d 2、約54%)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gal d 3,約12%)和溶菌酶(Gal d 4,約3%)已被確定為雞蛋過(guò)敏的主要變應(yīng)原[7-9],目前雞蛋過(guò)敏的診斷基本只是基于蛋清蛋白。但已有9.1%被診斷為雞蛋過(guò)敏的兒童通過(guò)食物口服激發(fā)試驗(yàn)證明了對(duì)輕微蛋清污染的蛋黃過(guò)敏[10],蛋黃過(guò)敏越來(lái)越受到人們的重視。血清白蛋白(Gal d 5)和YGP42(Gal d 6)是蛋黃的主要過(guò)敏原,Gal d 5 天然易獲取而Gal d 6 天然蛋白難以獲得[11-13]。最近大量研究表明被診斷為雞蛋過(guò)敏的兒童對(duì)雞蛋蛋黃是敏感的[14-16]。

單組分診斷(component-resolved diagnosis)即利用過(guò)敏單組分或重組表達(dá)的過(guò)敏原分子作為已知抗原來(lái)檢測(cè)相應(yīng)特異性IgE抗體(sIgE),與食物天然提取蛋白相比,可以有效減少混合抗原所產(chǎn)生的彼此干擾,避免雜蛋白引起的交叉反應(yīng),提高診斷價(jià)值,已應(yīng)用于臨床診斷中[17-18]。本文主要重組表達(dá)了蛋黃過(guò)敏原Gal d 6 蛋白,通過(guò)免疫學(xué)鑒定其過(guò)敏活性。這不僅對(duì)于禽蛋單組分診斷研究具有重要意義,同時(shí)也有利于禽蛋過(guò)敏的精細(xì)分化,禽蛋的攝入和過(guò)敏病程的管理[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質(zhì)粒載體pET28a 購(gòu)自安徽通用生物公司;BL21(DE3)感受態(tài) 由本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶XbaI,XhoI 均購(gòu)自大連寶生物公司;鎳柱(Invitrogen)、鼠抗人His單抗(sigma)、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE抗體(Sigma)、HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素(Sigma)等試劑 均購(gòu)自上海生物工程股份有限公司;雞蛋過(guò)敏陽(yáng)性血清24例 臨床診斷依據(jù)包括:典型的臨床過(guò)敏史,血清總IgE>100 kU/L,雞蛋sIgE>0. 35 kUA/L 等;陰性對(duì)照血清8 例 來(lái)自無(wú)任何雞蛋過(guò)敏史的體檢人群。

Gel Doc XR+凝膠成像儀、PowerPace Basic垂直電泳儀 Bio-rad;Allegra-64R低溫高速冷凍離心機(jī) Beckman;HHS-21-8恒溫水浴鍋 上海添時(shí)科學(xué)儀器;SYC-2102水平搖床 Crystal;DHP-9011電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器;KS-250C超聲破碎儀 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司;Synergy2多功能酶標(biāo)儀 Bio-Tek。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建基因表達(dá)載體 通過(guò)NCBI網(wǎng)址查詢獲得蛋黃Gal d 6的基因序列(P87498,1628-1912 aa),由安徽通用生物公司合成該基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Gal d 6。將收到含有重組質(zhì)粒的E.coliTop10進(jìn)行增菌實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件是37 ℃,220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳 次日用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,將獲取到的重組質(zhì)粒進(jìn)行XbaI/XhoI雙酶切,(25 μL酶切體系:載體質(zhì)粒8 μL,XbaI/XhoI各1 μL,10xBSA 2.5 μL,10X NEB Buffer 2.5 μL,H2O 10 μL)。然后調(diào)節(jié)2%膠濃度(0.2 g瓊脂糖粉溶于20 mL的TAE溶液中),電壓120 V,時(shí)間35 min,作瓊脂糖凝膠電泳,安徽通用公司Sanger法測(cè)序。

1.2.3 基因的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化單一菌落分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度10 μg/mL),37 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;按1∶100的比例稀釋過(guò)夜菌,轉(zhuǎn)接50 μL過(guò)夜培養(yǎng)物于5 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm=0.6左右;取出1 mL不添加誘導(dǎo)劑作為對(duì)照組,試驗(yàn)組加入IPTG至終濃度1 mmol/L,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組菌體離心,棄上清,重懸于100 μL PBS(pH7.4)緩沖液;冰浴條件下,超聲波破碎大腸桿菌。將未誘導(dǎo)菌液,誘導(dǎo)全菌液、上清、沉淀與5倍上樣緩沖液分別按比例混勻,沸水浴5 min,SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 表達(dá)條件優(yōu)化 目標(biāo)蛋白主要在包涵體中表達(dá),也存在可溶性表達(dá)。通過(guò)探索蛋白的表達(dá)條件,最終加大上清可溶性蛋白的含量,以便實(shí)現(xiàn)下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。所以設(shè)置不同的IPTG濃度、溫度、誘導(dǎo)時(shí)間。最后確定表達(dá)條件進(jìn)行純化。

1.2.5 蛋白純化 取100 μL binding buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素,pH8.0)110 μL重懸的上清與鎳柱在4 ℃混勻1 h,離心(3 min,4000 r/min)取上清液作為流出液F;加200 μL washing buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素pH8.0),離心(3 min,4000 r/min)留取兩次分別作W1,W2;再加50 μL Elution buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素pH8.0),離心留取四次分別作E1、E2、E3、E4。作SDS-PAGE檢測(cè)。所有步驟均在4000 r/min,3 min條件進(jìn)行。

1.2.6 蛋白透析復(fù)性 根據(jù)純化結(jié)果將收集的洗脫液E1E2E3E4加入到處理過(guò)的截留分子量是10 kD的透析袋中,扎緊透析袋兩端;將透析袋整體浸沒(méi)于2 L PBS緩沖液,在4 ℃條件下透析;換3次液后將樣品取出。

1.2.7 測(cè)定復(fù)性蛋白濃度 將復(fù)性蛋白用BCA法測(cè)定濃度。利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.000588X+0.14(R2=0.984)),用透析液調(diào)零。按A液∶B液=50∶1,96孔板兩個(gè)復(fù)孔每孔加10 μL蛋白和200 μL AB液,先加樣品,盡量不要起泡,避光。37 ℃孵育30 min,于562 nm處檢測(cè)驗(yàn)吸光度,得到相應(yīng)濃度。

1.2.8 與過(guò)敏血清結(jié)合活性鑒定 用CBS(碳酸鹽緩沖液)稀釋Gal d 6蛋白濃度至0.5 μg/well作為包被質(zhì)量并做復(fù)孔以減小誤差,37 ℃水浴鍋溫浴3 h后,4 ℃過(guò)夜。用PBST洗板3次拍干,每孔加200 μL含 2%甘氨酸的聚乙烯醇(PVA),置37 ℃ 封閉2 h,用PBST洗3次拍干;用PBST將24份雞蛋過(guò)敏患者血清和8份正常對(duì)照血清按1∶10稀釋,100 μL/well,37 ℃孵育2 h,PBST洗滌五次拍干;每孔加100 μL 1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的抗人IgE,置37 ℃孵育1 h,PBST洗板5次后拍干;每孔加入HRP的底物A和B各50 μL,避光顯色15 min。最后終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm。

將獲得的純化rGal d 6蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后以250 mA、60 min電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜完成后,用含2% BSA的TBST于37 ℃封閉2 h,封閉完用TBST漂洗3次,每次10 min;用含2% BSA的TBST稀釋1∶50的雞蛋過(guò)敏患者混合血清(取5個(gè)雞蛋過(guò)敏陽(yáng)性患者血清混合)于4 ℃孵育過(guò)夜;洗后,加入含2% BSA的TBST稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗人IgE 抗體(1∶5000)和以含5% BSA的TBST稀釋的HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素(1∶50000),37 ℃孵育1 h,用TBST漂洗3次,每次10 min;最后用ECL曝光,檢測(cè)rGal d6蛋白的免疫活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)ELISA結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P值<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體pET28a-Gal d 6的酶切、測(cè)序結(jié)果

圖1A圖是pET28a示意圖,紅色標(biāo)出是酶切位點(diǎn)連接位置,前后各有一個(gè)His標(biāo)簽。將表達(dá)載體pET28a-Gal d6用XhoⅠ和XbaI進(jìn)行雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示第二列紅色標(biāo)注小片段與插入片段大小基本一致(圖1B),將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)基本一致,證明表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-Gal d 6構(gòu)建成功。

圖1 表達(dá)載體pET28a-Gal d 6酶切鑒定Fig.1 Identification of pET28a-Gal d 6 plasmid digested with restriction enzyme

2.2 表達(dá)條件優(yōu)化

為了提高目的蛋白的表達(dá)量,分別從培養(yǎng)時(shí)間,培養(yǎng)溫度,誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化。圖2a、2b和2c是0.5、1、2 mmol/L IPTG濃度下,分別在25和37 ℃條件下進(jìn)行1、2、4 h培養(yǎng),紅色框處為目的條帶位置。固定誘導(dǎo)劑濃度,培養(yǎng)時(shí)間2 h最佳,培養(yǎng)溫度是37 ℃略高于25 ℃,結(jié)合不同濃度和上清產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)在0.5 mmol/L IPTG是最優(yōu)誘導(dǎo)濃度。所以經(jīng)優(yōu)化最佳誘導(dǎo)條件是培養(yǎng)溫度為37 ℃,IPTG濃度為0.5 mmol/L,培養(yǎng)時(shí)間為2 h。

圖2 表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of expression conditions注:M:Maker,B:未誘導(dǎo)全菌,T:誘導(dǎo)全菌,S:誘導(dǎo)菌體上清。 圖a、b、c分別為IPTG濃度為0.5、1、2 mol/L的條件下,當(dāng)溫度為25、37 ℃時(shí)培養(yǎng)1、2、4 h時(shí)目的蛋的表達(dá)情況。

2.3 蛋白的表達(dá)純化

根據(jù)SDS-PAGE,選取目的蛋白表達(dá)量最高的單克隆進(jìn)行甘油保菌并進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。因?yàn)閞Gal d 6在pET-28a條件優(yōu)化中雖在上清中表達(dá)量有所提高,仍以包涵體為主要存在形式,

所以采取變性再?gòu)?fù)性的方式進(jìn)行純化。圖3為rGal d 6表達(dá)純化的SDS-PAGE結(jié)果圖。在34～43 kD有一明顯單一條帶就是目的條帶,高純度。通過(guò)抗His標(biāo)簽抗體鑒定復(fù)性后蛋白見(jiàn)圖B,有單一條帶,驗(yàn)證為目的蛋白。經(jīng)BCA法定量,復(fù)性蛋白體積為2 mL,濃度為4.55 mg/mL,這是培養(yǎng)500 mL產(chǎn)生的蛋白,換成產(chǎn)率就是收獲量每升菌液可收獲重組蛋白約9.1 mg。

圖3 重組蛋白Gal d6表達(dá)純化SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein Gal d6 expression and purification注:M:蛋白分子量maker;1:未誘導(dǎo)菌體; 2:誘導(dǎo)全菌;3:誘導(dǎo)菌體上清;4:F;5、6:W1,W2; 7、8、9、10:E1、E2、E3、E4;11:復(fù)性蛋白。

2.4 活性鑒定結(jié)果

為驗(yàn)證rGal d6的免疫學(xué)活性,以rGal d6為包被抗原,24例雞蛋過(guò)敏患者單例血清中的sIgE為探針,進(jìn)行ELISA檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖4。雞蛋過(guò)敏患者血清組要高于正常陰性對(duì)照血清組,P值為0.0127<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明rGal d6可與雞蛋過(guò)敏患者血清中的sIgE反應(yīng),陽(yáng)性反應(yīng)率達(dá)到68%。

圖4 rGal d6與血清sIgE的反應(yīng)性分析Fig.4 Reactivity analysis of rGal d6 and sera sIgE注:positive:雞蛋過(guò)敏患者陽(yáng)性血清; negative:非過(guò)敏人群血清。

將純化復(fù)性后的重組蛋白與5例混合陽(yáng)性血清反應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖5。產(chǎn)生單一條帶,證明表達(dá)蛋白具有免疫活性。

圖5 rGal d 6 Western blot結(jié)果圖Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein Gal d 6注：M:蛋白分子量maker;1.陽(yáng)性血清;2.陰性血清。

3 討論與結(jié)論

因蛋黃脂類物質(zhì)豐富,給蛋白純化帶來(lái)不小困難,故多年來(lái)禽蛋過(guò)敏原主要集中在蛋白或蛋清,直到S. Quirce和ALVARO AMO先后報(bào)道蛋黃的兩個(gè)過(guò)敏原分別是Gal d 5和Gal d 6[19-20]。應(yīng)用基因工程方法表達(dá)Gal d 5和Gal d 6 抗原[21-23],無(wú)論對(duì)深入研究蛋黃過(guò)敏原表位分析和致敏機(jī)制,還是對(duì)建立有效的蛋黃過(guò)敏sIgE抗體分子診斷方法[24],二者均是非常重要的,特別是對(duì)于嬰幼兒禽蛋類過(guò)敏,準(zhǔn)確鑒別蛋黃過(guò)敏、還是蛋清過(guò)敏,或二者同時(shí)過(guò)敏,從而選擇食用雞蛋特定部分,對(duì)確保營(yíng)養(yǎng)和健康發(fā)育是十分重要的。

本文目的是制備Gal d 6重組蛋白,為建立蛋黃Gal d 6特異性IgE抗體方法提供優(yōu)質(zhì)抗原。Gal d 6是卵黃蛋白原-1(VTG-1)前體的C末端部分,在蛋黃中酶促裂解產(chǎn)生成熟蛋白[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本研究成功建立較高產(chǎn)量表達(dá)Gal d 6 工程菌,每升菌液可收集蛋白量達(dá)到9.1 mg,這為工業(yè)化制備Gal d 6蛋白具有重要意義。同時(shí),免疫印跡結(jié)果顯示目的蛋白與過(guò)敏血清顯示特異性條帶;且ELISA結(jié)果顯示,此蛋白與雞蛋過(guò)敏患者血清陽(yáng)性反應(yīng)率高達(dá)68%。此結(jié)果也說(shuō)明并非所有禽蛋過(guò)敏患者顯示對(duì)Gal d 6蛋白過(guò)敏?？傊?本文結(jié)果證實(shí)重組Gal d 6 具有一定生物活性,可以為建立Gal d 6 sIgE抗體分子檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ),以及對(duì)雞蛋過(guò)敏的精細(xì)分化,雞蛋的攝入和過(guò)敏進(jìn)程的管理非常重要。