王 錚,趙 宇,高曉晨,孫 堯,崔本海,高 冷,*

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012; 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院,吉林長春 130012; 3.通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司,吉林白城 137200)

鴻雁(Ansercygnoides)屬鳥綱鴨科[1]。雁血可作藥用,據(jù)《本草綱目》、《日華本草》、《千金食治》、《隨息居飲食譜》等十多部藥典、食譜記載,雁血能大補(bǔ)五臟,養(yǎng)陰益氣,暖胃開津,強(qiáng)身健體,并且對增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防癌、防“三高”等具有特殊醫(yī)療功效。

我國鴻雁人工養(yǎng)殖場日益增加，雁血資源豐富。血液作為肉制品行業(yè)中最大的副產(chǎn)品,在保存與加工方面仍存在一定困難[2],目前的應(yīng)用僅限于簡單制成血制品食用,或用作飼料,大部分的血液作為廢料被丟棄[3],利用率極低,這樣既會對環(huán)境造成污染,又會浪費了寶貴的雁血資源[4]。免疫系統(tǒng)是疾病防御的第一道防線,如今人們的不健康生活方式導(dǎo)致自身免疫力下降從而引發(fā)各類疾病[5],人們可以通過食用免疫活性肽來提高自身免疫力,且無毒副作用[6]?，F(xiàn)階段我國對雁血的研究甚少,因此對鴻雁血的特醫(yī)性食品研究及開發(fā)具有重要意義。

本研究以向海鴻雁的新鮮血液為原料,采用生物酶解技術(shù)提取新鮮雁血中的有效成分,確定最佳酶解條件,并對有效成分進(jìn)行分離純化。采用SDS-PAGE電泳技術(shù)測得酶解后有效成分的分子量分布情況。本研究擬通過研究雁血多肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖及對IL-2、INF-γ與PGE2分泌量的影響,初步探究雁血多肽的免疫調(diào)節(jié)作用,為今后雁產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴻雁血 吉林省白城市通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司提供;清潔級小鼠(60只，雌雄各半),體質(zhì)量18～22 g 吉林大學(xué)實驗動物中心提供(許可號:SYXK(吉)2016-0001);SephadexG-50 上海研卉生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清 上海聯(lián)碩生物科技有限公司;白細(xì)胞介素2(interleukin-2,IL-2)ELISA檢測試劑盒、干擾素γ(interferon-gamma,IFN-γ)ELISA檢測試劑盒、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)ELISA檢測試劑盒 上海晶抗生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(400 U/mg)、中性蛋白酶(60000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、復(fù)合蛋白酶(400 U/mg) 蘇柯漢(漲濰坊)生物工程有限公司；實驗所有試劑 均為分析純。

LQZ-211型落地式全溫振蕩器 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;LGJ-30冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;UV-3000PC紫外可見分光光度計 杭州俊升科學(xué)器材有限公司;TGL16M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;PH-050A型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;ReadMax1900型光吸收全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雁血多肽的酶解工藝研究

1.2.1.1 原料預(yù)處理 取新鮮鴻雁血2 L,加0.1%的檸檬酸三鈉抗凝,5000 r/min離心30 min,超聲2 h破膜,5000 r/min離心15 min,冷凍干燥得到雁血蛋白。

1.2.1.2 酶解工藝流程 雁血蛋白→蛋白酶酶解→滅酶→離心→冷凍干燥→雁血多肽

將20 g雁血蛋白溶于200 mL去離子水中,稱取一定的蛋白酶,在一定的溫度和pH下酶解一定的時間。酶解結(jié)束后,滅酶10 min,靜置冷卻,5000 r/min離心15 min,取上清液,冷凍干燥,以備后續(xù)實驗使用。

1.2.1.3 雁血多肽的蛋白酶選擇 首先選用中性蛋白酶(60000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、木瓜蛋白酶(400 U/mg)和復(fù)合蛋白酶(以上三種蛋白酶按1∶1∶1的酶活比例組成),在每一種蛋白酶的最佳酶解條件下,利用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度[7]。

1.2.1.4 雁血多肽單因素實驗 稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調(diào)節(jié)pH到7后加入4000 U/g的復(fù)合蛋白酶,分別在30、40、50、60、70 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,分別調(diào)節(jié)pH到6、7、8、9、10后加入4000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在50 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調(diào)節(jié)pH到7后,分別加入2000、3000、4000、5000、6000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在50 ℃下酶解5 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度。

稱取20 g雁血蛋白5份分別置于燒杯中,加入200 mL去離子水,調(diào)節(jié)pH到7后加入4000 U/g的復(fù)合蛋白酶,在50 ℃下分別酶解3、4、5、6、7 h后,將溫度升至100 ℃滅酶10 min,完全冷卻后以5000 r/min離心15 min,取上清液,采用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定水解度[8]。

1.2.1.5 雁血多肽響應(yīng)面優(yōu)化 選取影響水解度的三個因素分別為酶解溫度、pH、加酶量[9]。采用3因素3水平響應(yīng)面試驗,因素與水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.1.6 水解度測定 甲醛滴定法測定氨基氮含量[10],凱氏定氮法測定樣品中總氮含量[11],按下列公式計算:

1.2.2 雁血蛋白酶解前后的分子量分布測定 配制12%分離膠和5%濃縮膠。取1 mg樣品置于1 mL蒸餾水中,取20 μL樣品溶液置于離心管中,同時加入20 μL上樣Buffer,100 ℃煮沸10 min,12000 r/min離心1 min,取10 μL上清液上樣。電泳儀電壓80 V,樣品通過濃縮膠后將電壓調(diào)至120 V。電泳結(jié)束后剝出凝膠,浸泡在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中,染色結(jié)束后將凝膠置于脫色液中,脫色后將凝膠進(jìn)行掃描獲取圖像[12-13]。

1.2.3 雁血蛋白酶解前后免疫活性的比較

1.2.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 對小白鼠進(jìn)行頸椎脫臼致死,置于75%的乙醇中浸泡5 min。在超凈工作臺中進(jìn)行無菌分離脾臟,放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中。取200目的細(xì)胞篩,將脾臟放于細(xì)胞篩上,切成小塊,加入適量的全血及組織稀釋液,用注射器活塞輕輕研磨脾臟,將細(xì)胞懸液立即轉(zhuǎn)移到15 mL無菌離心管中,1500 r/min離心20 min。用吸管吸出中間乳白色的淋巴細(xì)胞層置于15 mL無菌離心管中,加入10 mL的PBS洗滌,1000 r/min離心10 min棄上清液,再加入5 mL的PRMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱備用[14]。

1.2.3.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗 按1.2.3.1方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液,加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔100 μL。試驗分為空白組(每孔加40 μL的RPMI-1640);協(xié)同 ConA刺激組(各組每孔分別加入未酶解雁血與雁血酶解產(chǎn)物20 μL,終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL,加ConA 20 μL,ConA的終濃度為5 μg/mL),每組6個復(fù)孔。置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45 h,每孔加 5 mg/mL的MTT溶液20 μL,培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后,1000 r/min 離心5 min,棄去上清,在每孔加入150 μL二甲基亞砜,低速振蕩10 min,在570 nm波長處測定吸光度OD值[15]。

1.2.4 雁血多肽的分離純化

1.2.4.1 超濾法分離雁血多肽 通過復(fù)合蛋白酶酶解得到雁血多肽溶液,將雁血多肽溶液倒入分子量為10 kDa的超濾管中,配平后使用4 ℃離心機(jī)中,5000 r/min離心30 min,取濾膜下的液體到另一離心管中,重復(fù)3次得到分子量小于10 kDa的雁血多肽溶液[16]。

1.2.4.2 凝膠過濾層析純化雁血多肽 經(jīng)超濾得到的雁血多肽溶液采用Sephadex G-50凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm)進(jìn)行分離。用去離子水對凝膠柱進(jìn)行平衡,平衡120 min后上樣,上樣量為2 mL,洗脫液為去離子水,洗脫速度為0.5 mL/min,紫外檢測波長為280 nm,每隔5 min收集各峰組分。重復(fù)上述分離操作以得到足夠的雁血多肽樣品進(jìn)行冷凍干燥備用[17-18]。

1.2.5 雁血多肽的免疫功能研究 按1.2.3.1的方法制備的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液,加入24孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,空白組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),其余各組分別加入不同質(zhì)量濃度的雁血多肽分離組分,使各組分的終濃度分別為 25、50、100、200 μg/L,再加入ConA使其終濃度為 5 μg/L,另設(shè)ConA單獨刺激組，每個孔加20 μL的ConA,使其終濃度為5 μg/mL，每組設(shè)6個復(fù)孔。于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,1500 r/min離心5 min,收集培養(yǎng)上清,-20 ℃保存,參照IL-2、IFN-γ、PEG2的ELISA檢測試劑盒說明書的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測培養(yǎng)上清中各細(xì)胞因子的含量[19-20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 蛋白酶的選擇結(jié)果 由表2可知,不同蛋白酶在其最佳條件下水解度最高為復(fù)合蛋白酶(28.05%),明顯高于其他蛋白酶,所以選用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解實驗。

表2 不同蛋白酶在最佳條件下的水解度Table 2 Degree of hydrolysis of different proteases under optimal conditions

2.1.2 雁血多肽的單因素實驗結(jié)果 由圖1a可知,隨酶解溫度提升,水解度呈上升趨勢,當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時,水解度最高。當(dāng)溫度高于50 ℃時,水解度呈下降趨勢。蛋白酶本質(zhì)上是具有生理活性的蛋白質(zhì),溫度過高時蛋白質(zhì)會發(fā)生變性,減少有效酶量,從而引起酶反應(yīng)速率下降,使得水解度下降。因此，酶解溫度選擇為50 ℃。由圖1b可知,當(dāng)pH達(dá)到7時,水解度最高。pH會直接影響酶和蛋白質(zhì)分子某些解離基團(tuán)的解離狀態(tài),只有在特定的pH條件下,酶和底物蛋白質(zhì)的解離基團(tuán)才能處于最易于結(jié)合并轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的解離狀態(tài)。因此，pH選擇為7。由圖1c可知,當(dāng)加酶量達(dá)到4000 U/g時,水解度最高。加酶量達(dá)到一定程度后,酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大,水解度不再增加。由于加酶量為300 U/g時，水解度較低，因此，加酶量選擇為4000、5000、6000 U/g。由圖1d可知,當(dāng)酶解時間達(dá)到5 h時,水解度最高。隨著反應(yīng)時間的增加,可參與反應(yīng)的底物量減少,蛋白酶活性下降,反應(yīng)速率放緩直至蛋白酶完全失活,反應(yīng)幾乎停頓,水解度幾乎不再增加。由于反應(yīng)時間的影響相對較小，因此選擇為5 h，后續(xù)不再優(yōu)化。

圖1 雁血多肽單因素實驗結(jié)果Fig.1 Single factor tests results of Anser cygnoides blood peptide

2.1.3 雁血多肽響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 如表3所示雁血多肽的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果,根據(jù)各項的回歸系數(shù)建立回歸模型,二次多項回歸方程為:

表3 雁血多肽的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results of Anser cygnoides blood peptide

Y=29.45-0.45A-0.46B-0.48C+0.28AB+0.21AC+0.27BC-1.04A2-0.82B2-0.94C2。

表4 雁血多肽響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 4 Response surface variance analysis result of Anser cygnoides blood peptide

圖2 各因素交互作用三維響應(yīng)面圖Fig.2 Three-dimensional response surface diagram of interaction of various factors

通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,確定最佳酶解工藝為酶解溫度46.96 ℃,pH6.61,加酶量4658.29 U/g,此時水解度為29.6839%。考慮到實驗設(shè)施的可操作性,對酶解工藝進(jìn)行修正:酶解溫度47 ℃,pH7,加酶量4500 U/g,酶解時間5 h。進(jìn)行3次重復(fù)實驗,水解度的平均值為29.29%，與預(yù)測值接近,說明該響應(yīng)面模型是科學(xué)有效的。

2.2 雁血蛋白酶解前后的SDS-PAGE電泳

由圖3可以清晰的看出雁血蛋白酶解前后的分子量分布,泳道3～6與泳道2相比條帶數(shù)明顯減少,說明均有降解效果。其中泳道3條帶數(shù)最少,說明復(fù)合蛋白酶的效果最佳,分子量在10 kDa以下。

圖3 SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE map注:泳道1蛋白Maker(10～250 kDa); 泳道2未酶解空白組;泳道3復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物; 泳道4中性蛋白酶酶解產(chǎn)物;泳道5木瓜蛋白酶 酶解產(chǎn)物;泳道6堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物。

2.3 雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官之一,是機(jī)體進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫的重要場所[21],脾淋巴細(xì)胞的增殖,可直接反應(yīng)細(xì)胞免疫情況[22]。通過小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實驗,觀測25、50、100、200、400 μg/mL濃度水平下,雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況的影響。結(jié)果如表5所示,協(xié)同ConA作用于小鼠脾淋巴細(xì)胞時,OD值均高于空白組,且呈一定量效關(guān)系。與空白組比較,在不同濃度下,雁血蛋白酶解前后均能協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,且在200 μg/mL濃度水平下復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物效果最佳(P<0.01)。

表5 雁血蛋白酶解前后對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 5 Effects of pre-and post-hydrolysis of Anser cygnoides blood protein on proliferation of mouse spleen

2.4 雁血多肽分離純化結(jié)果與分析

圖4所示,雁血多肽經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析柱分離,250 min后得到3個明顯主峰,分別將其命名為ACP1、ACP2、ACP3。

圖4 雁血多肽的凝膠層析Sephadex G-50洗脫曲線Fig.4 Eluting curve of Anser cygnoides blood polypeptide by gel chromatography Sephadex G-50

2.5 ACP1、ACP2、ACP3對脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2、INF-γ與PGE2的影響

IL-2是T細(xì)胞生長因子,能刺激其他T淋巴細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子的合成[23]。IFN-γ可調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的分裂增殖[24-25]。PGE2(前列腺素E2)是花生四烯酸經(jīng)過環(huán)加氧酶催化的代謝產(chǎn)物,是重要的炎癥因子,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[26-27]。由表6可見,ConA組 IL-2、IFN-γ分泌水平均高于空白組,PGE2均低于空白組。ACP1、ACP2、ACP3能協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ,其分泌量均高于空白組并呈一定的量效關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。而與空白組比較,ConA協(xié)同ACP1、ACP2、ACP3中的PGE2含量均有降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其中3種組分多肽在100和200 μg/mL濃度下效果較好,且ACP2在100 μg/mL濃度下效果最佳。

表6 ACP1、ACP2、ACP3對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、PGE2含量的影響Table 6 Effects of ACP1,ACP2 and ACP3 on the secretion of IL-2,IFN-γ and PGE2 by mouse spleen

3 結(jié)論

在制備雁血多肽時,確定最佳酶解工藝為酶解溫度47 ℃,pH7,加酶量4500 U/g,此時多肽水解度為29.29%,且使用復(fù)合蛋白酶酶解效果最佳;雁血蛋白酶解前后均能夠明顯促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,且在200 μg/mL濃度水平下復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物效果最佳;對雁血多肽進(jìn)行分級洗脫,得到ACP1、ACP2、ACP3;ACP1、ACP2、ACP3能夠明顯提升IL-2、INF-γ和降低PGE2的分泌量,且ACP2在100 μg/mL濃度下效果最佳。綜上所述,雁血多肽能夠促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能,具有一定的免疫調(diào)節(jié)性,且ACP2效果最明顯,為雁血多肽在免疫調(diào)節(jié)方面的合理應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供了有效的實驗數(shù)據(jù)。