侯小楨，張伊敏，林群超，章 斌

（韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041）

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸鈉鹽與多肽，已被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、功能性配料、鮮味料或通過(guò)與還原糖發(fā)生Maillard反應(yīng)制備熱加工味料［1-2］.蛋白質(zhì)水解方法主要有酸水解法、堿水解法及酶解法，酸水解法易產(chǎn)生氯丙醇，生成的香料仿真度低，且水解產(chǎn)物中色氨酸基本都會(huì)被破壞，目前該法基本被淘汰；堿水解法容易使氨基酸消旋，甚至?xí)捎卸竞Φ氖中詫?duì)映體，一般食品加工中不能采用.蛋白質(zhì)酶解法是利用酶的催化分解作用，將大分子的肉類(lèi)蛋白質(zhì)在一定程度上切割成小分子的肽類(lèi)和氨基酸.用酶解技術(shù)獲得的水解動(dòng)物蛋白含有大量的游離氨基酸，可以用于調(diào)味品的增香，增加風(fēng)味料的濃度，使制得的產(chǎn)品風(fēng)味明顯，滋味完美，可廣泛用于各種食品、保健食品及用作各類(lèi)天然香精的基料，該法是目前較為理想的制備方法，也是今后咸味調(diào)味料生產(chǎn)的主流趨勢(shì)［3-5］.目前已有不少采用蛋白酶水解的牛肉、雞肉、豬肉的報(bào)道，制得的動(dòng)物水解蛋白可用于制備肉類(lèi)香料.

粵東地區(qū)的海洋低值蝦類(lèi)資源極為豐富，但利用卻相對(duì)滯后；每年都有大量的低值蝦類(lèi)因各種原因被廢棄或加工成附加值很低的產(chǎn)品，或成為飼料等，而更多的低值蝦由于未被及時(shí)利用而排入海洋，造成資源的浪費(fèi)和海洋環(huán)境的污染.研究表明［6-7］，毛蝦這一低值蝦中含多種礦物質(zhì)元素，蛋白質(zhì)含量豐富，其中含有人體必需的8種氨基酸，是非常優(yōu)良的食物蛋白資源.而目前對(duì)這一優(yōu)質(zhì)資源的研究應(yīng)用相對(duì)較少.因此，本文以盛產(chǎn)于粵東地區(qū)的低值毛蝦為試材，在篩選最佳蛋白酶種類(lèi)基礎(chǔ)上，探討毛蝦的蛋白酶解影響因素，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其酶解工藝條件，以期獲得風(fēng)味良好的蝦味香料的反應(yīng)前體物質(zhì)，為毛蝦的高值化綜合利用提供一定試驗(yàn)參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蝦：購(gòu)于饒平海鮮綜合市場(chǎng)，-18 ℃冰柜儲(chǔ)存；Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）、Papain木瓜蛋白酶（5×105U/g）、Alcalase 堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、Neutrase 中性蛋白酶（1.5 AU/g）、Protamex復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司.濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、蒽酮、三氯乙酸等：均為分析純.

DDY-1C 型自動(dòng)定氮儀：北京興華真空儀表廠(chǎng)；UV755B 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AUW120型電子分析天平：日本島津公司；HJ-6磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；HHS11-4電熱恒溫水浴鍋：上海悅豐儀器儀表有限公司；L-8800氨基酸分析儀：日本日立公司.

1.2 方法

1.2.1 酶解工藝流程

毛蝦→曬干→去雜質(zhì)→粉碎→加水→預(yù)熱→酶解→升溫滅酶→離心→酶解液.

1.2.2 酶解單因素試驗(yàn)

按一定固液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 g/mL）配制毛蝦和水的混合物，加入不同量（500 U/g、600 U/g、700 U/g、800 U/g）的蛋白酶后，在不同pH（水的自然pH 6.8、pH 5.5、pH 7.0、pH 8.5）、不同酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）條件下，酶解不同時(shí)間（0、1、2、3、4、5、6 、7 h）；以酶解產(chǎn)物中的AAN含量和TCA可溶性氮含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選酶解條件.

1.3 試驗(yàn)指標(biāo)與測(cè)定方法

可溶性氮（TCA）含量的測(cè)定：參照遲海［8］所述方法進(jìn)行.水分含量的測(cè)定［9］：常壓干燥法；總氮含量測(cè)定［9］：微量凱氏定氮法；脂肪含量測(cè)定［9］：索氏提取法；還原糖測(cè)定：按《GB 5009.7-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品中還原糖的測(cè)定》進(jìn)行；灰分測(cè)定［9］：高溫灼燒法；氨基酸態(tài)氮（AAN）含量測(cè)定［9］：甲醛電位滴定法；總糖測(cè)定［9］：蒽酮比色法；游離氨基酸測(cè)定：按《GB 5009.124-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行；總氨基酸測(cè)定［9］：甲醛滴定法.

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蝦成分分析

試驗(yàn)所用原料毛蝦的主要成分、游離氨基酸和總氨基酸含量如表1、表2所示.由表1可看出，毛蝦蛋白質(zhì)含量豐富，高達(dá)66.48%；表2測(cè)定結(jié)果表明毛蝦蛋白質(zhì)中各類(lèi)氨基酸的組成合理，富含人體健康所需的8種必須氨基酸，其中5種必須氨基酸含量超過(guò)2 000 mg/100 g，因此具有很好的開(kāi)發(fā)前景.

2.2 蛋白酶篩選

表1 毛蝦主要成分的含量

依據(jù)所購(gòu)酶的最適活力條件及前期預(yù)試驗(yàn)，在各酶的最適條件下；固液比為1∶5 g/mL，加酶量為E/S = 600 U/g，50 ℃下水解5 h，酶解效果如圖1、圖2 所示，可見(jiàn)Protamex 和Flavourzyme 的AAN和TCA可溶性氮含量都比較高，酶解效果較好，Papain次之，而Alcalase和Neutrase較弱；但結(jié)合表3的酶解液感官評(píng)定結(jié)果，可看出Protamex酶解效果雖然較好，但蝦香味較弱，且鮮味也不夠突出；Papain的酶解效果雖不及Protamex，但其酶解液口味較好，回味甘甜；Flavourzyme作用后的酶解液蝦香濃郁，后味較好；Alcalase和Neutrase無(wú)論從酶解效果和感官評(píng)定上都相對(duì)較差，且兩種酶的價(jià)格也相對(duì)昂貴.綜合酶解效果和酶本身的購(gòu)買(mǎi)成本考慮，選用Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶為試驗(yàn)用酶.

表2 毛蝦的游離氨基酸和總氨基酸含量

圖1 各種蛋白酶對(duì)AAN含量的影響

圖2 各種蛋白酶對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

2.3 風(fēng)味蛋白酶酶解毛蝦的單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶用量對(duì)酶解效果的影響

一定條件下，酶解反應(yīng)速度與酶濃度成正比；但當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值，所有酶分子已被底物所飽和，即酶分子與底物結(jié)合部位己被占據(jù)，速度則不再增加［3-4］.從圖3和圖4可看出：AAN值和TCA可溶性氮值均隨酶用量增加而增加，但增加幅度不明顯，可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)條件下，底物的量是一定的，酶用量較大時(shí)，E/S 值越大，在水解的起始階段水解速度較快，底物迅速減少，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，底物減少到一定量引起水解速度的增加減緩或不再增加.酶解5 h時(shí)，添加量為700 U/g的毛蝦液中的AAN 值僅比600 U/g 的增加0.0157 g/100 mL，TCA 可溶性氮含量也僅多了0.013 g/mL.因此，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，確定風(fēng)味蛋白酶用量為600 U/g.

2.3.2 固液比對(duì)酶解效果的影響

酶解反應(yīng)過(guò)程中，提高底物濃度一定程度上可加快反應(yīng)速度［5］.圖5和圖6表明：隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，AAN含量和TCA可溶性氮含量隨固液比增大呈先增大后降低的變化趨勢(shì)；且在固液比1∶4時(shí)達(dá)至最高.造成這一現(xiàn)象的可能原因是固液比過(guò)高，底物濃度和酶的有效濃度均降低，不利于底物在溶解狀態(tài)下與酶有效結(jié)合，酶解效果較差；固液比過(guò)低時(shí)，除酶解效果不理想外，還將導(dǎo)致后期濃縮工序的時(shí)間延長(zhǎng)；因此，綜合考慮確定本試驗(yàn)的最佳固液比為1∶4.

表3 蛋白酶作用后的酶解液感官評(píng)定

圖3 酶用量對(duì)AAN含量的影響

圖4 酶用量對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

圖5 固液比對(duì)AAN含量的影響

圖6 固液比對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

2.3.3 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

溫度主要從兩個(gè)方面直接影響蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)的效率：一是對(duì)蛋白酶催化反應(yīng)速度的影響，即溫度過(guò)低，蛋白酶活性不足，酶解反應(yīng)速度相應(yīng)較低；溫度過(guò)高，則易使蛋白酶失去活性，同樣降低酶解反應(yīng)速率.二是對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響，即溫度升高使酶分子更活躍，蛋白質(zhì)與酶分子的碰撞更頻繁，從而提高蛋白酶的酶解速度.從圖7 和圖8 可看出：隨著溫度的升高，毛蝦液中的AAN 含量和TCA可溶性氮含量先升高后降低，于50 ℃時(shí)達(dá)到最高，因此，確定酶解溫度在50～55 ℃范圍較適宜.

圖7 酶解溫度對(duì)AAN含量的影響

圖8 酶解溫度對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

2.3.4 pH值對(duì)酶解效果的影響

pH值對(duì)酶催化反應(yīng)的影響包括兩個(gè)方面：影響酶的穩(wěn)定性和影響酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物.酶只有處于游離狀態(tài)時(shí)，才能與底物結(jié)合，不同的pH 值會(huì)使酶處于不同的游離狀態(tài)，產(chǎn)生不同的空間構(gòu)象從而影響酶的活力和酶解效果.由圖9和圖10可知，pH 7.0的酶解液中AAN含量和TCA可溶性氮含量最低，pH 5.5、pH 8.5次之；但采用添加緩沖鹽的酶解液，其風(fēng)味均較差；而采用自來(lái)水的自然pH 6.8 為pH 的酶解液，其AAN 含量和TCA 可溶性氮含量最高，整體風(fēng)味也最好，這可能是因?yàn)樵谧詠?lái)水的自然pH 6.8下，酶分子上的必需基團(tuán)處于最佳的解離狀態(tài)，最適合與底物結(jié)合并催化底物反應(yīng)，從而使得反應(yīng)速度加快，酶解效果更好.因此，確定采用自來(lái)水的自然pH 6.8為最佳pH值.

圖9 pH值對(duì)AAN含量的影響

圖10 pH值對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

從圖11和圖12可看出，毛蝦液中的AAN含量和TCA可溶性氮含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，酶解6 h后的增加速率變緩，可能是由于隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物逐漸減少，產(chǎn)物逐漸增加，導(dǎo)致反應(yīng)速度逐漸下降；且試驗(yàn)中觀察到酶解時(shí)間超過(guò)8 h后的酶解液，顏色加深并產(chǎn)生異味，對(duì)后期進(jìn)行美拉德反應(yīng)帶來(lái)不利的影響；同時(shí)，延長(zhǎng)酶解時(shí)間會(huì)增加生產(chǎn)成本和微生物繁殖的機(jī)會(huì).因此，試驗(yàn)選擇最佳酶解時(shí)間為6 h.

圖11 酶解時(shí)間對(duì)AAN含量的影響

圖12 酶解時(shí)間對(duì)TCA可溶性氮含量的影響

2.4 酶解工藝的優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 Box-behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，考慮到后續(xù)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，以AAN 含量為指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4.

2.4.2 回歸方程模型的建立

運(yùn)用SAS RSREG程序?qū)?5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，確定試驗(yàn)回歸方程如下：

Y = 0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3-0.022792X22-0.00725X2X3-0.028292X32

對(duì)該模型方程及回歸系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5.

由表5 可看出，方程的F 值=38.77369 ＞f0.01（9，5）=10.2，說(shuō)明該方程是高度顯著的，從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)也可看出，失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明模型是很理想的.X2（時(shí)間）、X3（加酶量）對(duì)Y（AAN含量）具有線(xiàn)性影響，X1（溫度）、X2和X3具有二次影響，而交互項(xiàng)的影響不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)因子與響應(yīng)值間不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系.根據(jù)F值的大小，可判定各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值Y的影響依次是：X2（時(shí)間）＞X12（溫度的二次項(xiàng)）＞X32（加酶量的二次項(xiàng)）＞X22（時(shí)間的二次項(xiàng)）＞X3（加酶量）.

2.4.3 響應(yīng)面分析

由圖13 可看出隨著溫度的升高，AAN含量先增加再降低；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AAN含量呈上升趨勢(shì)；隨著加酶量的增加，AAN含量先明顯增加，之后增長(zhǎng)緩慢.由圖14可知，當(dāng)加酶量一定的時(shí)候（X3=0），隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，AAN含量逐漸增大，而酶解時(shí)間沒(méi)有優(yōu)化值；隨著溫度的變化，AAN 含量也隨之增加，達(dá)到一個(gè)最高點(diǎn)后，又逐漸減?。辉跍囟?～0.3（55～56.6 ℃），時(shí)間在設(shè)定時(shí)間內(nèi)，響應(yīng)面有最大值.由圖15可知，當(dāng)時(shí)間一定的時(shí)候（X2～0），隨著溫度的升高和加酶量的增加，AAN含量都是先增加后逐漸減??；在溫度0～0.3（55～56.6 ℃），加酶量0～0.3（600～630 U/g）之間，響應(yīng)面有極大點(diǎn).由圖16 可知，當(dāng)溫度一定的時(shí)候（X1=0），隨著加酶量的增加，AAN含量先增加后逐漸減少；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AAN含量顯著增加，達(dá)到最大的時(shí)候已經(jīng)超過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間；在加酶量0～0.3（600～630 U/g）之間，在時(shí)間在設(shè)定時(shí)間內(nèi)，響應(yīng)面有最大值.

表5 回歸方程的方差分析

圖13 溫度（X1）、時(shí)間（X2）、加酶量（X3）對(duì)Y響應(yīng)的模型曲線(xiàn)圖

2.4.4 優(yōu)化結(jié)果

考慮到酶解時(shí)間、酶解液風(fēng)味與后期美拉德反應(yīng)液的風(fēng)味關(guān)系，在最大限度提高游離氨基酸含量的基礎(chǔ)上，對(duì)Y進(jìn)行優(yōu)化；得到的最佳組合為：固液比1∶4，pH為自來(lái)水的自然pH 6.8，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間6 h，加酶量600 U/g，此條件下的理論值Y=0.963；得此優(yōu)化條件下的試驗(yàn)驗(yàn)證值為Y=0.958，且得到的酶解液風(fēng)味較好，蝦香濃郁，進(jìn)一步證明響應(yīng)面法得到的最佳工藝條件的可靠性.

圖14 溫度（X1）和時(shí)間（X2）對(duì)AAN含量的影響

圖15 溫度（X1）和加酶量（X3）對(duì)AAN含量的影響

圖16 時(shí)間（X2）和加酶量（X3）對(duì)AAN含量的影響

3 結(jié)論

對(duì)毛蝦的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，包括水分、粗蛋白、脂肪、灰分、總糖等成分，其中粗蛋白達(dá)到66.48%，是良好的蛋白質(zhì)資源；游離氨基酸為72.10 g/L，總氨基酸達(dá)到54 360 mg/100 g，其中人體必需氨基酸含量豐富，蘊(yùn)含巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值.

經(jīng)不同蛋白酶的初步篩選，確定試驗(yàn)用酶為風(fēng)味蛋白酶.單因素試驗(yàn)確定風(fēng)味蛋白酶的酶解條件為：固液比1∶4，加酶量600 U/g，以自來(lái)水的自然pH為6.8，在50～55 ℃下酶解5～6 h，AAN含量達(dá)到0.88 g/100 mL.

通過(guò)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度三因素相互關(guān)系的模型：Y=0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3- 0.022792 X22-0.00725X2X3-0.028292X32.同時(shí)，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定酶解最佳條件為：固液比1∶4，pH為自來(lái)水的自然pH6.8，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間6 h，加酶量600 U/g，此條件下的AAN 含量理論值Y=0.963 g/100 mL.

通過(guò)酶解所得的毛蝦酶解產(chǎn)物可作為香料的前體物質(zhì)或基香使用，也可將酶解產(chǎn)物直接作為原料或配料加工成調(diào)味醬等休閑食品，但具體工藝參數(shù)條件仍需依據(jù)其實(shí)際用途或目標(biāo)產(chǎn)品要求進(jìn)一步探討.