亢舜彤 吳 桐 陳焯輝 張萌琦

（中南大學湘雅醫(yī)院神經內科 長沙410008）

人體有數(shù)以百億計的神經元維持生理活動，腦功能主要依賴于神經元的聚集及其形成的神經網絡。腦復雜生理功能的維持依賴于微神經網絡結構的完整，因此對腦神經血管網絡結構及連接的研究有助于深入理解和認知腦的復雜功能［1］。腦血管疾病的病理生理過程涉及血管和神經結構復雜的損傷修復，當出現(xiàn)異常時，神經血管單元將發(fā)生結構與功能重塑，使機體微神經網絡穩(wěn)態(tài)失調，進而影響患者機體生理活動，嚴重時可能導致患者神經功能缺損甚至死亡［2］。精準的腦部結構解析提供神經網絡的精細結構，是深入神經科學研究的關鍵。因此，獲得三維超高分辨率數(shù)字化成像和立體網絡形態(tài)結構參數(shù)是評估中樞神經系統(tǒng)疾病病理改變的重要前提。

同步輻射顯微成像技術已被公認為探索生物三維結構的有力工具，其分辨率最高可至亞微米級。中國上海同步輻射裝置具備強大的中等能量光源，當高能電子接近光速在儲存環(huán)中運動時，其運動方向在磁場的作用下發(fā)生變化，產生的電磁輻射因而具有高能量、高相干、高方向性、高效率、準平行等特性，比實驗室或醫(yī)用X射線源所獲得的光束高出十個量級以上，可為本研究提供高精度數(shù)據［3］。目前，利用同步輻射光源對生物腦組織結構進行的相關科學研究往往集中在血管網絡，而涉及單個及多個神經元網絡連接成像方面的研究較少。

早期的高爾基染色法能完整地標記包括胞體、樹突、樹突棘甚至軸突在內的整個神經元形態(tài)，使人類對神經元的微觀結構、其在腦內的宏觀分布及腦內局部網絡的連接有了新的認識。高爾基染色法經不斷改良，衍生了多種染色方法，本實驗應用的高爾基-考克斯（Golgi-Cox）染色法是一種經典的形態(tài)學染色方法，通常用于神經生物學的樹突形態(tài)及樹突棘研究。研究表明，采用高爾基-考克斯染色法可獲得單個神經元的樹突形態(tài)結構，但由于缺乏合適的細胞顯微結構成像方法，難以獲得準確的3D神經元結構信息等因素，這限制了其在神經元形態(tài)精準分析中的應用［3］。組織切片常用于表征小至微米級的血管神經形態(tài)，但切片制備過程通常耗時，僅能提供二維切面信息，而無法提供神經元3D信息，切片處理還會破壞腦標本結構的完整性，對于神經元形態(tài)的研究具有一定的局限性。因此，開發(fā)新型微成像方法對于在生理和病理條件下非損傷性檢測復雜顯微神經網絡變化并提供高分辨率成像具有極為重要的意義［4］。新興的同步輻射技術突破了傳統(tǒng)光學成像方法的衍射極限，利用亞微米至微米量級的極高分辨率，可以實現(xiàn)對物質顯微結構的無損、三維成像。本文旨在將高爾基-考克斯染色法與同步輻射成像相結合，發(fā)展出一種快速高通量的成像方法，以期能夠獲取全腦高爾基-考克斯染色神經元的形態(tài)及其3D解剖結構學信息。

1 材料與方法

1.1 小鼠腦樣本制備

實驗選用正常成年雄性C57小鼠12只，均飼養(yǎng)于動物實驗室內的獨立換氣籠中，并分籠飼養(yǎng)，12 h晝夜變換光照，給予水和標準飼料，供其自由攝取。人工控制室內環(huán)境溫度22～24℃，相對濕度60%～80%。有動物死亡時需及時依次補入。所有小鼠隨機等分為A、B兩組，每組6只，其中B組再隨機等分為兩組，每組3只。B組內小鼠均進行高爾基-考克斯染色處理，但一組取全腦樣本，一組取局部海馬區(qū)組織方塊。本實驗所有操作和動物手術均已取得中南大學動物倫理委員會的批準。

用10%水合氯醛溶液（4 mL·kg-1，腹腔注射）過量麻醉兩組小鼠后，于仰臥位在胸部做一個長皮膚縱切口，再于左肋和胸骨交界處打開胸腔，剝離心包膜，以暴露心臟和升主動脈根部，并將針頭插入左心室至主動脈口，調整灌注流速后固定針頭。剪開右心耳，予以37℃預熱后生理鹽水持續(xù)灌注，控制流速以保證液柱在莫菲氏管中直線流動，直至肝臟由棕色轉為淡白色，且右心房流出液體由紅轉白后，停止灌注。灌注過程中適當改變小鼠的體位，以使小鼠毛細血管中的血液得到充分置換。術后予以新鮮預熱的4%多聚甲醛溶液進行血管內灌注固定，可見小鼠的四肢和尾巴出現(xiàn)抽搐。小鼠肢體僵硬后灌注完畢，即刻手術剝離A、B組小鼠全腦組織，放入4%多聚甲醛溶液固定約24 h。

A組的腦組織樣品再分別用50%、75%、85%、95%、100%乙醇各處理24 h進行梯度酒精脫水，后保存在4℃100%酒精中，掃描前自然風干，于凍存管常溫密封保存，用于同步輻射光源掃描。

B組的腦組織樣品后續(xù)操作步驟如下：

1）配置Cox液：將1 g升汞（HgCl2）和1 g重鉻酸鉀（K2Cr2O7）溶于64 mL蒸餾水，將0.8 g鉻酸鉀（K2CrO4）溶于16 mL蒸餾水，再將兩者混合均勻，過濾后取上清液。

2）固定、染色：將小鼠腦組織取出，用細線系住腦組織將其懸掛于盛有新鮮配置的Cox液的棕色試劑瓶中，用鋁箔紙包瓶，置于溫度為20～25℃的避光環(huán)境中進行固定。固定1～2 d后，更換新配置的Cox液，每30～60 d更換一次新鮮Cox液。鼠腦需要在Cox液中固定、染色至少180 d。

3）黑化、沖洗：將固定、染色后的腦浸入1%氫氧化鋰（LiOH）中，用量約40 g/腦，使標本黑化，在搖床上搖動24 h，搖床回轉直徑20 mm，轉速1 r·s-1，后續(xù)的脫水步驟中浸有標本的棕色瓶也需要放在搖床上，搖床轉速相同。之后用流水沖洗標本24 h。

4）脫水：把沖洗后的鼠腦依次浸入50%、75%、85%、95%、100%酒精、100%酒精-丙酮（1:1）、100%丙酮24 h，然后浸入另一瓶100%丙酮中10 h，使標本徹底脫水。不同濃度脫水劑的用量至少為8 g/腦。

5）掃描前自然風干，于凍存管常溫密封保存，用于同步輻射光源掃描。

1.2 同步輻射成像

1.2.1 實驗裝置

本實驗在中國科學院上海應用物理研究所上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）X射線成像與生物醫(yī)學應用光束線站（BL13W1）完成。上海光源全能量注入器包括150 MeV電子直線加速器、3.5 GeV增強器及高能和低能輸運線。電子束由加速器加速至150 MeV，經低能輸運線注入增強器后能量提高至3.5 GeV，再經高能輸運線注入3.5 GeV高性能電子儲存環(huán)，電子束沿著束流軌道循環(huán)運動，在磁場作用下改變運動方向時釋放同步輻射。BL13W1線站配備電離室、高空間分辨X射線探測器、大視場X射線探測器、X射線熒光探測器、六軸樣品臺、大承重電動臺及圖形工作站等。該線站利用插入件扭擺器作為光源，經液氮冷卻雙晶單色器將白光單色化，為醫(yī)用成像提供光子能量范圍為8～72.5 keV非聚焦單色光，光子通量密度可達3×1010s-1·mm-2@20 keV，最大光斑尺寸可達45 mm（水平）×5 mm（垂直）。實驗站使用VC架構設計自動化控制程序采集數(shù)據，將樣品放置于指定位置后即可觸發(fā)探測器進行X射線投影及圖像數(shù)據采集。樣品到光源點的距離為34 m，探測器到樣品的最大距離為8.0 m，優(yōu)化能量和距離等參數(shù)可以獲得高質量成像［5-6］。

1.2.2 掃描操作

分別將晾干的A、B組腦組織樣本牢固地固定在樣品臺中心，并保證其垂直于光路。為了獲得最佳的腦血管相位對比圖像，X射線光束的尺寸約為45 mm（水平）×5 mm（垂直），使用帶有Si（111）和Si（311）晶體的雙晶單色儀對X射線進行單色，其最佳能量為20.0 keV。A組進行CT掃描時，旋轉臺以0.25（°）·s-1的速度旋轉180°，原始的Tomo圖像由16位水冷X射線單個像素大小為3.25 μm的成像探測器拍攝，曝光時間為0.8 s，樣品到檢測器（硅漂移探測器（Silicon Drift Detector，SDD））的距離為50 cm。B組進行CT掃描時，旋轉臺以0.25（°）·s-1的速度旋轉180°。全腦組織原始的Tomo圖像由16位水冷X射線單個像素大小為3.25 μm的成像探測器，曝光時間為0.8 s，樣品到檢測器的距離為5 cm。海馬區(qū)組織方塊原始的Tomo圖像由16位水冷X射線單個像素大小為0.65 μm的成像探測器拍攝，曝光時間為0.8 s，樣品到探測器的距離為5 cm。

1.2.3 數(shù)據處理

通過參數(shù)計算，單個腦樣本的二維原始投射總數(shù)為900幅。同時，每180幅投影圖像采集一次白場圖像（記錄光路中無樣品時的圖像），最后收集暗場圖像（記錄無光照射時的圖像）。所有二維原始投射圖像使用Image-Pro Plus 6.0圖形處理軟件進行處理，采用背景減法技術消除白場平場和暗場暗圖像的干擾，同時通過調整對比度、設置低通濾波和銳化增強等處理，獲得最佳的投影圖像。

所得到的二維slice可根據血管及其他組織的不同結構特征和灰度分布，設置適當?shù)倪^濾器，以增強神經元的結構圖像并抑制其他組織或圖像的噪聲。選取可視化軟件Amira 6.0對數(shù)據塊中的神經元進行追蹤重建。Amira 6.0可實現(xiàn)從多平面和多角度觀察重建后處理的連續(xù)切片圖像，同時通過分塊加載和體素轉換，不僅可以重建腦表面血管形態(tài)的三維構象，還能提取神經網絡的三維結構，進而對局部神經網絡進行精細化重建。圖1為神經元多色成像流程圖。

圖1 神經元多色成像流程圖Fig.1 Procedures of neuron multicolor imaging

2 結果

2.1 神經元二維顯影

小腦是機體的平衡調節(jié)中樞，海馬區(qū)是具有記憶功能的重要腦區(qū)，二者在研究腦部神經功能中有重要意義。分別選取包含小腦的腦組織及從海馬部位獲取的局部組織塊進行掃描后得到斷層顯微成像數(shù)據，在圖2中顯示了鼠腦冠狀面切面圖像。X射線吸收襯度成像利用物質的電子密度不同而對射線的吸收不同而形成圖像襯度，未經處理的生物軟組織密度相近，對射線吸收程度相似，形成圖像襯度有限，無法特異性顯示神經元細胞。高爾基-考克斯染色屬于重金屬染色法，是神經元顯影的特異性染色方法，可以僅對神經元染色而背景無干擾。對樣品進行高爾基-考克斯染色，被染色的神經元注入高密度元素，其和未被染色的低密度組織區(qū)域對射線的吸收程度即存在顯著差異。采用同步輻射成像，獲得的圖像具有較高的對比度和空間分辨率，可使神經元能夠與周圍組織清晰地區(qū)分開來，因此圖像中為亮色結構即為神經元。

圖2（a）為使用單個像素大小為3.25 μm的成像探測器拍攝的未經高爾基-考克斯染色處理腦組織，此時僅能觀察到切面的大體輪廓，所攝區(qū)域無明顯差異，無法顯示神經元分布。圖2（b）為使用單個像素大小為3.25 μm的成像探測器拍攝的經高爾基-考克斯染色腦組織，觀察到腦實質中包括皮質和髓質在內不同層次的二維構筑，同時可顯示分散在整個腦區(qū)的亮色神經元，為后續(xù)獲取神經元定位與組織解剖3D關系提供基礎。圖2（c）為使用單個像素大小為0.65 μm的成像探測器拍攝的經高爾基-考克斯染色處理的海馬區(qū)組織方塊，與圖2（b）相比分辨率更高?？捎^察到該區(qū)域神經元的形態(tài)以及部分神經元的相互連接，展示腦內的精密的微神經網絡。該部分研究通過選取不同分辨率的探測器掃描樣品內部結構，得到的結果證明單個像素大小為0.65 μm的成像探測器更適合觀測局部神經網絡的精細結構，但觀測視場明顯減小，要求樣本足夠小以適合視場觀測范圍。單個像素大小為3.25 μm的成像探測器可以獲得整體結構，但在觀測顯微結構方面略有不足。本實驗為多尺度解析靶區(qū)的3D神經網絡形態(tài)結構提供實驗依據。

圖2 二維slice腦切片圖(a)單個像素大小為3.25 μm的成像探測器掃描的未經高爾基-考克斯染色的鼠腦，(b)單個像素大小為3.25 μm的成像探測器掃描的高爾基-考克斯染色的鼠腦，(c)單個像素大小為0.65 μm的成像探測器掃描的高爾基-考克斯染色海馬區(qū)組織塊Fig.2 Two-dimensional slice of brain slice(a)Mouse brain without Golgi-Cox staining scanned by an imaging detector with a single pixel size of 3.25 μm,(b)Mouse brain with Golgi-Cox staining scanned by an imaging detector with a single pixel size of 3.25 μm,(c)Hippocampal tissue cubes with Golgi-Cox staining scanned by an imaging detector with a single pixel size of 0.65 μm

2.2 神經網絡成像

小腦所含神經元豐富，約占整個腦部神經元的50%，小腦中大部分神經元分布于小腦皮層。高爾基-考克斯染色可特異性標記神經元，尤其能對樹突棘等精細結構進行染色，結合Amira軟件將CT掃描所得鼠腦圖像渲染，即可顯示小腦神經元網絡分布。圖3（a）與圖3（b）為小腦冠狀面不同層面神經網絡渲染圖，在圖像中可區(qū)分小腦皮質及髓質區(qū)域。皮質區(qū)域顯示出明顯層次，由表及里可分為多個小腦小葉，即構成小腦皮質的葉片板層，其表面小葉多為橫向，相互平行。皮質所包含的神經元如星狀細胞、籃狀細胞、浦肯野細胞、高爾基細胞和顆粒細胞等在渲染圖像中均可清晰顯示。圖3（c）為小腦矢狀面3D神經網絡渲染圖，該斷面上神經元的分布、皮質的分層結構及其與髓質的毗鄰關系亦可清晰分辨。圖3D為小腦水平面3D神經網絡渲染圖，除顯示小腦層次結構外，還捕捉到在皮質神經元分布密集處像亮度更高。這一結果表明，高爾基-考克斯染色結合同步輻射3D成像技術有潛力成為未來探索神經元的區(qū)域分布的新手段。小腦內神經元分布眾多且連接緊密，選擇感興趣的區(qū)域進行追蹤神經元的相互聯(lián)系，可以實現(xiàn)對神經元結構與形態(tài)數(shù)據的獲取，對深入解析小腦結構有重要意義。我們從不同角度及不同層次解析小腦3D神經網絡構筑及組織結構關系，為建立小鼠局部功能腦區(qū)神經網絡的3D數(shù)字化解剖圖譜提供了新思路，將此方法應用于不同功能腦區(qū)神經元的定位追蹤并構建全腦神經連接網絡，對于了解全腦結構有重要意義。

圖3 小腦3D神經網絡成像(a,b)不同層面冠狀位小腦3D神經網絡渲染圖，(c)矢狀位小腦3D神經網絡渲染圖，(d)水平位小腦3D神經網絡渲染圖Fig.3 Cerebellar 3D neural network imaging(a,b)3D neural network rendering of coronary cerebellum at different levels,(c)3D neural network rendering of sagittal cerebellum,(d)3D neural network rendering of horizontal cerebellum

2.3 局部神經元連接

使用3D重構軟件Amira對獲取全腦組織的掃描數(shù)據進行成像優(yōu)化處理，可獲得小鼠腦神經網絡3D可視化圖像。通過手動選擇獲得多選定的局部單個神經元、多個神經元形態(tài)與連接信息（圖4），由此可觀測單個神經元的結構與形狀，同時其與周邊神經元的連接方式等信息。對單個神經元進行放大處理可區(qū)分胞體連接及軸突連接，為研究神經元之間的相互作用途徑、探索神經元通過軸突連接形成的局部神經網絡環(huán)路提供了可能的途徑，有助于深入理解神經元的細胞行為及細胞間通信。此外，重構結果顯示出了在單細胞水平上分析細胞間異質性的潛力，對闡明細胞相關功能及生物學機制有關鍵作用。獲得局部神經連接網絡的重建圖像后，還可以利用偽彩將不同形態(tài)、大小的神經元進行標記，獲得局部范圍的神經元定位與互聯(lián)信息，如圖5所示。選定感興趣區(qū)域即可獲得該區(qū)域所有神經元信息，為研究重要區(qū)域的神經元的結構與功能提供了三維網絡數(shù)據。

圖4 神經元成像 (a)單個，(b)三個，(c)多個Fig.4 Neuron imaging(a)Single neuron,(b)Three neuron,(c)Multiple neuron

圖5 神經元多色成像Fig.5 Multicolor imaging of neurons

3 討論

神經元尺寸微小、形態(tài)復雜，普通染色方法難以對其三維結構進行解析，而高分辨率顯微掃描儀器的發(fā)展使研究中樞神經系統(tǒng)中微神經網絡成為可能。同步輻射X射線成像作為一種具有高空間分辨率的先進成像技術，為微神經網絡的亞微米級無損成像提供了平臺。同步輻射光源具有高光通量、高亮度、高準直性、高相干度和寬光譜等特點，與高分辨率CCD探測器相結合，不僅獲得神經元三維形態(tài)結構，還可提高檢測的有效空間分辨率，滿足微神經網絡成像研究的要求［7-8］。本研究采用3D神經網絡分析法，利用X射線吸收襯度成像技術對小鼠腦神經網絡的形態(tài)進行3D表征，為深入研究精細神經血管網絡構筑、各類病理條件下顯微神經血管網絡3D重塑及相關干預治療提供有力評估手段［9］。

人體生理功能的維持依賴于神經網絡結構完整，神經元病變可導致人腦功能障礙，因此亟需建立一種可行有效的方法捕捉腦部神經元，為今后研究提供策略［10-14］。本次實驗利用同步輻射吸收襯度成像技術，通過對比高爾基-考克斯染色前后的鼠腦圖譜，顯示出高爾基-考克斯染色結合同步輻射吸收襯度成像技術在實現(xiàn)全腦神經網絡三維可視化方面的優(yōu)越性；通過對比不同直徑探測器的優(yōu)缺點，為選擇合適的探測手段提供了依據；通過聚焦于小腦渲染圖像，清晰可辨小腦的層次結構顯示了本技術的可行性及實用性。應用本實驗建立的技術流程，鼠腦樣本經進一步處理后可原位顯示直徑20 μm左右的神經元的立體結構形態(tài)，并成功重構神經網絡，所得信息用于研究局部神經元網絡連接之間的相互作用，為研究神經元之間相互作用提供新的視角。傳統(tǒng)的組織學染色方法僅提供標本的二維形態(tài)信息，且這類破壞性的樣本處理方法會導致血管和軸突再生研究中的數(shù)據失真；而同步輻射掃描不僅可以短時間內實現(xiàn)全腦成像，還能同時保證標本的完整性，提高樣本的利用率。同時，該技術還可用于研究各類中樞神經系統(tǒng)疾病下（如腦血管病、癲癇、神經退行性疾病等）腦3D神經網絡的改變，實現(xiàn)無損、精準地追蹤疾病早期的神經血管3D構筑變化，為進一步制定有效的治療干預手段提供了有力的技術支撐。

4 結語

本研究闡明了利用高爾基-考克斯染色結合同步輻射技術構筑腦神經高分辨3D可視化網絡的可行性和有效性，將血管神經網絡共成像及對其進行精準的定量分析應用于臨床研究，為檢測和評估神經血管再生修復策略的效能提供有力的工具。本研究力求以新方法為腦神經網絡研究提供豐富的3D影像學信息，為探究腦神經網絡結構及其在病理狀態(tài)下的顯微變化提供新思路。

致謝 感謝中國科學院上海應用物理研究所X射線成像及生物醫(yī)學應用線站（BL13W1）全體科研人員對本項目的支持和幫助。