蔣 斕，劉婷婷，李曉勤

0 引言

哺乳期乳腺炎是哺乳期婦女乳房損傷并有細(xì)菌入侵導(dǎo)致的乳腺炎癥。金黃色葡萄球菌(Staphylcoccusaureus，SAU)是哺乳期乳腺炎最常見的病原菌。哺乳期婦女是一個(gè)特殊人群，幾乎所有藥物都能夠通過(guò)血漿乳汁屏障進(jìn)入乳汁，故使用抗菌藥物時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格考慮對(duì)哺乳嬰兒是否有不良影響。SAU可表達(dá)多種毒力因子，如殺白細(xì)胞素(pvl)、腸毒素A(sea)、中毒性休克綜合征毒素-1(TSST-1)、表皮剝落素、溶血毒素A(hlA)、凝聚因子A(clfA)、酚溶調(diào)制肽(psm-mec)、耐熱核酸酶(nuc)、血漿凝固酶等[1]，賦予了SAU對(duì)宿主細(xì)胞的黏附性。細(xì)胞毒素和侵襲毒素賦予了SAU對(duì)宿主組織細(xì)胞的破壞性。SAU中毒力基因的高檢出率是導(dǎo)致乳腺炎癥的病理基礎(chǔ)。SAU細(xì)胞毒素基因與侵襲毒素基因高檢出率可能與創(chuàng)面或傷口久治不愈相關(guān)。本研究擬對(duì)我院乳腺科哺乳期乳腺膿腫患者分離的60株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和64株甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)耐藥性與毒力基因進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 我院乳腺科哺乳期乳腺膿腫患者分離的SAU，連續(xù)收集2015年1月至2017年12月分離的MRSA 60株和MSSA 64株，使用法國(guó)梅里埃公司VITEK-2 COMPACT 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀進(jìn)行鑒定和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.2 SAU DNA模板制備 挑取純菌落置于1.5 ml Eppendorf管中，加入0.45%滅菌生理鹽水1 ml充分混勻。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)制備DNA模板。取適量混勻細(xì)菌液在Eppendorf管內(nèi)加入20 mg/ml溶菌酶溶液200 μl，37 ℃水浴60 min，之后再70 ℃水浴14 min，12 000 r/min離心30 s，上清液為基因檢測(cè)模板液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR引物：根據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)合成PCR引物，見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，3 min。循環(huán)條件：94 ℃，30 s；55.6 ℃(mecA)、56.6 ℃(pvl)、51.8 ℃ (hla)、56.6 ℃ (clfA)、52.6 ℃ (nuc)、55.6 ℃(sea)、55.6 ℃(psm-mec)，30 s；72 ℃，1 min，循環(huán)30次；延伸72 ℃，5 min；保存于4 ℃。PCR試劑為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外儀下出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相同分子量的條帶為陽(yáng)性。

1.3 結(jié)果判斷 按照2019年版CLSI[2]的標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。苯唑西林的MIC值≥4 mg/L者即判斷為MRSA。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用WHONET 5.6 軟件對(duì)藥敏數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，MRSA、MSSA耐藥率以及毒力基因陽(yáng)性的差異采用卡方檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 MRSA組和MSSA組耐藥情況 哺乳期乳腺膿腫患者分離了60株MRSA和64株MSSA，青霉素耐藥率高(≥90.6%)，替加環(huán)素、利福平、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、萬(wàn)古霉素、莫西沙星、利奈唑烷敏感率高(≥98.3%)。MRSA對(duì)克林霉素、四環(huán)素的耐藥率明顯高于MSSA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.21、11.41，P<0.05)。MRSA中紅霉素耐藥率略高于MSSA，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增片段

表2 MRSA組和MSSA組耐藥情況

2.2mecA基因檢測(cè)結(jié)果 采用mecA基因的PCR引物分別對(duì)臨床分離的MRSA和MSSA菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，60株MRSA均具有mecA基因的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性條帶，64株MSSA均無(wú)mceA基因PCR擴(kuò)增條帶。

2.3 毒力基因檢測(cè)結(jié)果 哺乳期乳腺膿腫患者中MRSA的毒力基因陽(yáng)性率略低于MSSA。MSSA的pvl毒力基因表達(dá)明顯高于MRSA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.20，P<0.05)，見表3。

表3 MRSA組和MSSA組毒力基因攜帶情況

3 討論

哺乳期急性乳腺炎多因排乳不暢、乳汁淤積、乳頭皸裂，引起細(xì)菌感染。乳汁排出困難者需局部疏通；已形成乳腺膿腫者，需外科切開引流；配合抗菌藥物治療時(shí)，必須考慮乳汁中藥物含量及對(duì)乳兒的不良反應(yīng)。若選用哺乳期禁用藥物，需考慮暫?；蚪K止哺乳后乳汁淤積導(dǎo)致炎癥加重的可能。哺乳期急性乳腺炎致病菌主要為革蘭陽(yáng)性菌中的SAU[3]，其致病性強(qiáng)，攜帶多個(gè)毒力基因，若不及時(shí)治療或治療不徹底易復(fù)發(fā)，不能為乳兒哺乳，嚴(yán)重影響產(chǎn)婦和乳兒的身心健康。

本研究連續(xù)收集哺乳期乳腺膿腫患者分離出的60株MRSA和64株MSSA，對(duì)青霉素和紅霉素的耐藥率較高(≥90.6%、≥59.4%)，因此，選用抗生素時(shí)，青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類不應(yīng)作為治療首選藥物。菌株對(duì)利福平、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶、莫西沙星的敏感性較高(≥98.3%)，替加環(huán)素、萬(wàn)古霉素和利奈唑烷未出現(xiàn)中介和耐藥情況。MRSA中紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥率分別為70%、53.3%、23.3%，低于相關(guān)報(bào)道(83.72%、72.09%、44.19%)[3-4]，可能與地域差異、攜帶毒力基因多少有關(guān)。MRSA對(duì)克林霉素、四環(huán)素的耐藥率均高于MSSA，這與多重耐藥特性有關(guān)。MRSA是由mecA基因介導(dǎo)的耐藥，此基因編碼青霉素結(jié)合蛋白(PBP)2a，與β-內(nèi)酰胺類藥物的親和力下降，不能有效阻礙細(xì)胞壁肽聚糖層合成而導(dǎo)致耐藥。根據(jù) 2017年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)，國(guó)內(nèi) MRSA 的臨床平均檢出率為 35.3%(10.3%～62.1%)[5]，因此，應(yīng)該根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗生素。

SAU的定植、感染和預(yù)后與其攜帶的毒力因子有關(guān)，本研究哺乳期乳腺膿腫分離MSSA毒力因子(pvl、hla、nuc、sea)攜帶率高于MRSA，其中hla、clfA、nuc毒力因子在MSSA和MRSA中具有高攜帶率(≥98.3%)，與王俊瑞等[6]研究中hla與clfA結(jié)果一致。pvl是一種細(xì)胞外毒素，可損傷細(xì)胞膜，使細(xì)胞溶解[7]，攜帶該毒力因子的SAU毒力更強(qiáng)，與感染后疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，是區(qū)分社區(qū)獲得性及醫(yī)院獲得性感染的標(biāo)志之一。本研究MRSA攜帶毒力因子pvl明顯低于MSSA(P<0.05)，與劉根焰等[8]研究結(jié)果一致。SAU可通過(guò)噬菌體溶源轉(zhuǎn)換機(jī)制獲得產(chǎn)pvl能力，并可能通過(guò)質(zhì)粒途徑在不同菌株間水平傳播，在壞死性皮膚損害、軟組織損害等疾病中起重要作用。因此，需要關(guān)注MSSA攜帶pvl毒力因子對(duì)哺乳期不良影響。SAU細(xì)胞毒素中psm-mec與葡萄球菌感染后釋放細(xì)胞毒性因子、前炎癥因子和免疫逃逸有關(guān)[9]。psm是葡萄球菌分泌的一類多肽，具有促炎、參與免疫調(diào)節(jié)和影響生物膜形成的作用。從MRSA菌中可分離到由SCC-mec介導(dǎo)的同樣有psm特征的psm-mec[10]，本研究?jī)H在MRSA中攜帶psm-mec毒力基因。nuc基因編碼的核酸酶能水解宿主細(xì)胞的核酸(含 DNA、RNA)。hla分子可插入紅細(xì)胞的細(xì)胞膜疏水區(qū)形成微孔，對(duì)多種哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用。clfA基因表達(dá)纖維蛋白原結(jié)合蛋白A，又稱為聚集毒素，均與SAU在宿主細(xì)胞中的定植能力有關(guān)[11]。nuc、hla和clfA毒力基因均在SAU中表達(dá)。

針對(duì)哺乳期發(fā)生乳腺膿腫患者，應(yīng)分離病原菌，并進(jìn)行藥敏檢測(cè)。對(duì)于MRSA，應(yīng)加強(qiáng)防控和隔離治療；如果為MSSA，需監(jiān)測(cè)其所攜帶的毒力基因，評(píng)估其對(duì)泌乳期宿主組織細(xì)胞的破壞和對(duì)乳兒的不良影響。